Газета «Новости медицины и фармации» Нефрология (297) 2009 (тематический номер)

Вступ

Нирки більше, ніж інші органи, залежать від функціонального стану ендотелію судин (ЕС) у зв''язку з наявністю в них величезного пулу ендотеліоцитів (близько 30 % усієї ендотеліальної вистілки організму), який є першим шаром на шляху ультрафільтрації в капілярах клубочків. ЕС регулює процеси тканинного гомео­стазу й судинного тонусу, коагуляцію, міграцію й проліферацію клітин, бере участь у реакціях запалення, тканинної регенерації й фіброзу, визначає фільтраційну функцію нирок, дифузію води та іонів. Сучасні дані свідчать про важливу роль ендотеліальної дисфункції судин (ЕДС) у патогенезі й прогресуванні гломерулонефриту (ГН) (И.Н. Бобкова та ін., 2005; R. Joannides et al., 1997; N. Futrakul et al., 2000; J. Passauer et al., 2000; Y. Miki et al., 2002; M.B. Rookmaaker et al., 2003). Роль структурних змін ендотеліальних клітин нирок у прогресуванні патологічного процесу доведено на моделі ГН у щурів (H. Uchimura et al., 2005).

Можна припустити, що існує тісний взаємозв''язок порушень ендотеліальної функції судин (ЕФС) при ГН не тільки з проліферацією та структурними змінами ендотеліоцитів гломерулярних капілярів та артеріол, але й з іншими патологічними механізмами, які лежать в основі розвитку ГН, — запальними (у тому числі імунокомплексного генезу) і склеротичними ушкодженнями клубочків, канальців та строми нирок. Окрім того, важлива роль у формуванні ушкоджень ЕФС належить порушенням метаболізму вазоактивних медіаторів, таких як оксид азоту, ендотелін-1 (ЕТ1), прозапальні цитокіни й вазоактивні ейкозаноїди. У зв''язку з цим з''ясування значимості окремих ланок патогенезу ГН у контексті ЕДС є необхідним для розробки нових ефективних методів патогенетичної терапії захворювання.

Мета дослідження даної роботи — встановити патогенетичну роль ЕДС при ГН, взаємозв''язок її з тяжкістю морфологічних ознак захворювання в клініці та експерименті, патоморфоз і динаміку окремих складників ЕФС під впливом патогенетичної терапії.

Матеріал і методи дослідження

Під спостереженням перебували 49 хворих на хронічний ГН (25 чоловіків і 24 жінки) віком від 16 до 67 років (у середньому — 36 ± 2,4 року). У 29 % пацієнтів діагностовано нефротичний синдром, у 35 % констатовано систолічну артеріальну гіпертензію, у 33 % — діастолічну. Хворі мали I–III стадію хронічного захворювання нирок (величини клубочкової фільтрації склали від 33 до 129 мл/хв, у середньому — 118 ± 7,5 мл/хв). Усім пацієнтам виконано пункційну нефробіопсію. У 76 % випадків установлено мезангіопроліферативний ГН (МПГН), у 24 % — мезангіокапілярний (МКГН). У 78 % спостережень зафіксовано тубулоінтерстиціальний компонент (ТІК).

Експериментальна частина роботи виконана на 59 самцях білих щурів масою 190–220 г. ГН моделювали шляхом триразового введення щурам у корінь хвоста повного ад''юванту Фрейнда з нирковим антигеном і розчином селезінкової дезоксирибонуклеїнової кислоти великої рогатої худоби. Доза першого введення ад''юванту Фрейнда складала 5 мг/кг маси тварини, дозу другого введення знижували вдвічі, а дозу третього зменшували ще вдвічі. Додатково тварин піддавали іонізуючому опроміненню в дозі 0,48 Гц через 14 діб після першого і за 9 діб після другого введення ад''юванту. Моделювання ГН здійснювали протягом одного місяця. Усіх щурів виводили з експерименту за 2 місяці від його початку в умовах ефірного наркозу шляхом декапітації. Утримання тварин і всі маніпуляції над ними проводили відповідно до загальних вимог та положень Європейської конвенції із захисту хребетних тварин.

Нефробіопсію виконували на фоні атаралгезії під контролем ультразвукового дослідження нирки. Використовували методику TrueCut із застосуванням високошвидкісного пістолету Biopty-Bard. Гістологічні зрізи забарвлювали гематоксиліном-еозином, альціановим синім і за Ван-Гізоном, здійснювали PAS-реакцію, застосовували імуноферментний (з пероксидазною міткою) та імунофлюоресцентний (визначення імуноглобулінових депозитів) методи дослідження тканин нирок. Ураження окремих ниркових структур (клубочків, канальців, строми, судин) оцінювали в балах (від 0 до 3), підраховували середній показник ушкоджень (СПУ).

Біохімічні дослідження виконували на аналізаторі BS-200 (Китай). Визначали швидкість клубочкової фільтрації за формулою Кокрофта — Гольта. Уміст оксиду азоту в крові оцінювали за кінцевими продуктами його метаболізму — нітритами (NO2), використавши методику із застосуванням реактиву Гріса. Абсорбцію розчину вимірювали спектрофотометричним методом на приладі SPECORD-200 (Німеччина) при довжині хвилі 546 нм. Визначення рівнів ЕТ1, циклічного гуанозинмонофосфату (cGMP), інтерлейкінів (IL) 1β та 6, фактора некрозу пухлини (TNF) α, простацикліну (PgI2) і тромбоксану (Tx) A2 в плазмі крові здійснювали імуноферментним методом (ридер PR2100 Sanofi Diagnostic Pasteur, Франція) з використанням наборів реагентів ProCon (Росія) і Amercham (Великобританія). Як контроль обстежено 30 практично здорових людей (12 чоловіків і 18 жінок) віком від 18 до 60 років.

Статистичну обробку отриманих результатів досліджень проведено на комп''ютері за допомогою варіаційного, кореляційного, регресійного, одно- і багатофакторного (ANOVA/MANOVA) дисперсійного аналізу (програми Microsoft Excel і Statistica). Оцінювали середні значення, їх помилки, коефіцієнти кореляції, критерії регресії, дисперсії, Стьюдента, Уїлкоксона — Рао, хі-квадрат і вірогідність статистичних показників.

Результати і їх обговорення

У 31 % хворих на мезангіальні ГН встановлено проліферацію ЕС, у 27 % — проліферацію ендотелію капілярів клубочків. Ступінь останньої залежить від морфологічного типу захворювання. Стадія ГН впливає на стан ендотелію капілярів, відзначається істотна дія морфологічного варіанта. У 41 % спостережень депозити імуноглобулінів (Ig) виявлялися в капілярах субендотеліально. Глибина судинних порушень визначає депозити IgA в капілярах, а ступінь проліферації капілярних ендотеліоцитів позитивно корелює з відкладанням IgM і IgG.

Серед обстежених хворих виділено 3 групи: із проліферацією ендотелію капілярів клубочків (1-ша), із субендотеліальними відкладеннями IgA, IgG, IgM (2-га) і з проліферацією ендотелію артеріол нирок (3-тя). 1-шу групу склали 27 % хворих, 2-гу — 41 %, 3-тю — 32 %. Якщо депозити Ig виявлено в усіх пацієнтів із МКГН, то при МПГН — тільки в 24 % випадків. Стадія захворювання впливає на ступінь проліферації ендотелію капілярів, а вираженість ТІК — на проліферацію ендотелію великих судин. Регресійний аналіз відображає пряму залежність функції нирок від змін ендотеліоцитів капілярів, а кореляційний аналіз виявляє позитивний зв''язок тяжкості ТІК й ушкодження ендотеліальних клітин судин.

Морфологічна форма ГН впливає на ступінь змін ендотелію капілярів і рівень відкладення в них Ig. Зафіксовано прямий кореляційний зв''язок між ступенем проліферації ендотеліальних клітин і імуноглобуліновими депозитами, при цьому співвідношення між характером змін ендотеліальних клітин капілярів і судин відсутні. Якщо на проліферацію ЕС впливає СПУ капілярів, канальців, строми і судин, то на стан ендотелію канальців —

СПУ тільки капілярів і судин. Існує залежність СПУ капілярів від вираженості змін ендотелію капілярів і відкладання під ними Ig. СПУ канальців і судин залежить від стану ендотелію артеріол.

На інтегральну тяжкість морфологічних ознак ГН впливає ступінь проліферації ендотеліальних клітин капілярів клубочків і великих судин. За даними дисперсійного аналізу, ступінь проліферації ендотелію капілярів діє на тяжкість зрощень капілярних петель з капсулою клубочків і проліферації епітелію капсули, розвиток мікропівмісяців, склероз/гіаліноз клубочків, строми і судин. Вираженість проліферації ендотелію артеріол, у свою чергу, має вплив на проліферацію мезангіальних клітин, збільшення мезангіального матриксу, лімфогістіоцитарну інфільтрацію інтерстицію і склероз судин. Субендотеліальні відкладання Ig в капілярах впливають на стовщення їх базальної мембрани.

Регресійний аналіз засвідчує пряму залежність ураження ендотелію артеріол від ступеня збільшення мезангіального матриксу, проліферації епітелію капсули, лімфоплазматичної інфільтрації й склерозу строми. Разом із тим виявляється обернене співвідношення зі ступенем стовщення базальної мембрани капілярів клубочків. Ці дані дозволяють припустити більш значну проліферацію ендотелію артеріол у хворих на МПГН. Спостерігається також прямий кореляційний зв''язок вираженості проліферації ендотелію капілярів клубочків із відкладанням у них IgG і IgM, а також депозитів IgG у мезангіумі та стромі.

За даними багатофакторного дисперсійного аналізу, існує вплив нефротичного синдрому на інтегральний стан ЕФС. У хворих із нефротичним синдромом менші показники нітритемії та тромбоксанемії, разом із тим підвищені концентрації IL-1β, TNF-α і PgI2. Інтегральний стан ЕФС також тісно пов''язаний з морфологічною формою ГН і тяжкістю ТІК, що впливає тільки на рівень ЕТ1. Серед усіх показників ЕФС у хворих із різними варіантами захворювання лише концентрація PgI2 вища при МКГН порівняно з МПГН. Саме цей показник більший у пацієнтів із наявністю ТІК.

СПУ капілярів має вплив на параметри NO2, ET1 і IL-1β, СПУ канальців — на ЕТ1, СПУ строми — на ЕТ1 і IL-1β, СПУ судин — на NO2, IL-1β, IL-6 і TNF-α. Регресійний аналіз демонструє пряму залежність СПУ капілярів і канальців від умісту в крові ЕТ1, а СПУ строми — від концентрації IL-1β. Як свідчить ANOVA/MANOVA, на інтегральний стан ЕФС впливає ступінь збільшення мезангіального матриксу, периваскулярної інфільтрації та склерозу строми. У свою чергу, параметри NO2 і PgI2 обернено залежать від площини мезангіального матриксу. Величини концентрації ЕТ1 прямо пов''язані з клітинною інфільтрацією та склерозом строми. Рівень NO2 в крові визначає проліферацію епітелію капсули Шумлянського, cGMP — периваскулярну інфільтрацію, ЕТ1 — зміни епітелію канальців, IL-6 — зрощення капілярних петель із капсулою клубочків, TNF-α — лімфогістіоцитарну інфільтрацію строми, ейкозаноїдів (PgI2, TxА2) — збільшення мезангіального матриксу.

Зафіксовано вплив на загальний стан ЕФС ступеня відкладання в інтерстиції IgA и IgM, причому при ГН від рівня IgA прямо залежить рівень ЕТ1, а вміст IgM визначає показники NO2 і IL-6. Рівень ЕТ1 впливає на депозити в капілярах клубочків IgG і IgM, а IL6 — на відкладання в стромі IgA і IgM. Вираженість ураження ЕС впливає на стан ЕФС. Існує зв''язок з цими морфологічними ознаками ГН рівня нітритемії, до того ж проліферація ендотеліальних клітин капілярів визначає вміст у крові ЕТ1 і IL-1β. Проліферація ендотеліальних клітин артеріол взаємопов''язана з концентрацією TNF-α. Уміст у крові ET1 і IL-1β залежить також від ступеня депозитів Ig під ендотеліоцитами капілярів.

У хворих із проліферацією гломерулярних ендотеліоцитів виявилися вірогідно меншими показники NO2 і cGMP, але більшими — ЕТ1, IL-1β і TNF-α. Збільшення ступеня проліферації ендотеліальних клітин артеріол супроводжується підвищенням у крові концентрації IL-6, що відбувається на фоні зменшення вмісту ТхА2. Регресійний аналіз показує пряму залежність вираженості проліферації ендотеліоцитів капілярів клубочків від рівня ЕТ1. Ступінь проліферації ендотеліальних клітин обернено залежить від параметрів тромбоксанемії.

На інтегральний стан ЕФС у тварин з експериментальним ГН впливають ступені проліферації мезангіальних клітин, збільшення мезангіального матриксу й склерозу строми. Однофакторний дисперсійний аналіз виявляє вірогідну дію на параметри NO2 — збільшення мезангіального матриксу, на ЕТ1 — дистрофії, атрофії, некроз епітелію канальців, на IL-1β — проліферації епітелію капсули, на TNF-α — склероз/гіаліноз клубочків. Зафіксовано залежність ступенів проліферації мезангіоцитів і збільшення мезангіального матриксу від показників нітритемії; проліферації епітелію капсули і склерозу строми — від концентрації IL-1β; тільки склерозу строми — від TNF-α.

Регресійний аналіз констатує пряму залежність параметрів TNF-α у крові від ступеня тяжкості ушкодження ниркових структур. При цьому продукція цього цитокіну, поряд з його агоністом IL-1β, визначає СПУ. На фоні глюкокортикоїдної та імунодепресивної терапії СПУ вірогідно зменшується, а при додаванні до комплексу терапевтичних заходів інгібіторів ангіотензинперетворюючого ферменту (ІАПФ), які є стимуляторами ЕФС, — ще більш суттєво. Дещо несподіваним виявилося частішання випадків склерозу клубочків і строми у тварин, що отримували ІАПФ. Разом із тим ІАПФ сприяють зменшенню мезангіального матриксу й зникненню випадків проліферації епітелію капсули Шумлянського. Як показує дисперсійний аналіз, включення до комплексу лікування ІАПФ зменшує залежність концентрацій у крові IL-1β і IL-6 від ступеня вираженості морфологічних ознак ГН, але було виявлено вплив TNF-α. Рівень NO2 пов''язаний з тяжкістю склерозу строми.

Проліферації ендотеліоцитів капілярів клубочків і артеріол нирок при експериментальному ГН виявляються відповідно в 100 і 63 % тварин, що частіше, ніж в інтактних особин, у 2,7 і в 3,3 раза відповідно. Лікування тварин дексаметазоном і циклофосфамідом призводить до зменшення кількості випадків проліферації ендотеліоцитів капілярів клубочків до 87 %, а додаткове використання ІАПФ — до 83 %. Разом із тим збільшується частота реєстрації проліферації ендотеліальних клітин артеріол. Однофакторний дисперсійний аналіз свідчить про вплив тяжкості ураження ендотеліальних клітин артеріол на параметри нітритемії. Як показує регресійний аналіз, ступінь проліферації ендотеліоцитів капілярів клубочків залежить від показників у крові ET1 і IL-6.

На стан ЕС впливають вираженість проліферації мезангіоцитів та епітеліальних клітин капсули клубочків, збільшення мезангіального матриксу, склерозу клубочків та інтерстицію. Натомість від ступеня змін ендотеліоцитів гломерулярних капілярів залежить проліферація мезангіальних клітин, а від ендотеліальних клітин артеріол — проліферація мезангіоцитів, збільшення мезангіального матриксу та склероз строми. Ступінь змін ендотеліоцитів артеріол впливає на рівень у крові нітритів. Проліферація ендотелію гломерулярних капілярів прямо пов''язана із синтезом вазоконстрикторного ЕТ1 і прозапального IL-6, про що свідчать дані дисперсійного й регресійного аналізів. Виявляється обернена залежність концентрації в крові стійких продуктів метаболізму оксиду азоту від ступеня змін ЕС.

Отже, доведено роль ЕДС в патогенезі ГН, а на підставі вивчення характеру морфологічних змін нирок у хворих з мезангіальними ГН і у тварин з моделлю захворювання виявляється проліферація ендотеліоцитів гломерулярних капілярів та артеріол, ступінь тяжкості якої визначає інші зміни в клубочках, канальцях й стромі й залежить від стану ЕДС, що коригується на фоні патогенетичної терапії. За нашими даними, у хворих на мезангіальний ГН показник у крові ЕТ1 > 7 пг/мл відображає тяжкість ураження клубочків і канальців, а рівень IL-1β > 80 пг/мл — строми нирок. У свою чергу, концентрація в крові ЕТ1 > 10 пг/мл вказує на виражений ступінь проліферації ендотеліоцитів гломерулярних капілярів, а ТхА2 < 7 нг/мл — ендотеліальних клітин артеріол, що має неабияку практичну значимість.