Газета «Новости медицины и фармации» Нефрология (297) 2009 (тематический номер)

Взаимодействие проникающих макрофагов с резидентными паренхиматозными клетками играет важную роль в развитии фиброза почек [5]. Ранее нами был представлен возможный механизм взаимодействия нейтрофилов и моноцитов-макрофагов с эндотелием сосудов через системы ICAM и VСAM, что может играть важную роль в инициации процесса повреждения капилляров клубочков у больных с хронической болезнью печени (ХБП) с помощью провоспалительных интерлейкинов, m-кальпаинов, химазы и катепсина G [2]. Уменьшение количества капилляров приводит к прогрессирующим тубулоинтерстициальным изменениям, связанным со снижением кровотока в почках, при этом корковое вещество почки становится более ишемизированным [8]. Частью быстрой начальной реакции на повреждение почек при хроническом гломерулонефрите и диабетической нефропатии (ДН) может быть индукция NO-синтаз (NOS) in situ и инфильтрация перенхимы почек лейкоцитами с наличием iNOS-положительных клеток в клубочке, что было подтверждено в образцах ткани при биопсии почек больных гломерулонефритом [6]. В нейтрофилах больных ХБП активирована преимущественно iNOS, а это приводит к разобщенности NOS и повреждению эндотелия [4]. Эспериментальные исследования показали, что нарушение синтеза NO может изменить уровень проте­инурии, лейкоцитарной инфильтрации и других проявлений повреждения, таких как тромбоз, пролиферация и гиперпродукция матрикса [6, 9]. Однако пока еще нет единого мнения относительно роли NO, произведенного NOS in situ в почках больных ХБП. В связи с этим в настоящем исследовании предпринята попытка выявить связь между плотностью капилляров, наличием лейкоцитов и активностью NO-синтаз в тканях почек при ХБП различной нозологии.

Проанализированы результаты обследования 514 больных в возрасте 35–65 лет (237 мужчин, 277 женщин), находившихся на лечении в Институте терапии, из которых у 171 больного был диагностирован хронический гломерулонефрит, у 176 — диабетическая нефропатия, у 167 — гипертоническая болезнь (группа сравнения). Контрольную группу составили 20 здоровых лиц соответствующего пола и возраста. Больные были разделены на 3 основные группы: I группа — 128 пациентов с микроальбуминурией; II группа — 74 больных с протеинурией и III группа — 312 больных без наличия белка в моче. Материалом для морфологического исследования служили фрагменты почек, взятые при аутопсии у 18 больных ДН, обусловленной сахарным диабетом 2-го типа, умерших от осложнений коронарного атеросклероза (острый инфаркт миокарда, асистолия), а также 5 больных хроническим гломерулонефритом II–III стадии без анемии и выраженной артериальной гипертензии, у которых при жизни была произведена чрескожная нефробиопсия. При установлении диагноза ХБП пользовались классификацией, принятой на II Национальном съезде нефрологов Украины (2005). Активность процессов перекисного окисления липидов изучали по концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови; состояние антиоксидантной системы оценивали по концентрации SH-гpyпп, активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазы [12, 14]. Из воспалительных модуляторов изучали содержание межклеточной адгезивной молекулы-1 (ICAM-1, CD-54), сосудистой адгезивной молекулы-1 (VCAM-I, CD-106), E-селектина (CD62L) [13, 16]. Содержание фактора Виллебранда определяли по ристомицин-активированной агрегации тромбоцитов, а содержание катепсина G, активность химазы и m-кальпаинов в сыворотке крови — с помощью иммуноферментного фотометра-анализатора Humareader, Human (Германия) [8]. Исследовали функциональные свойства форменных элементов крови: изучали адгезивные свойства моноцитов, содержание липидов и маркер апоптоза Fas/TNFRSF6 (CD95) в составе их клеточных мембран [3, 30]. Определяли выделение моноцитами урокиназы и PAI-I под влиянием ангиотензина II и гликированных протеинов [30]; исследовали ФМЛФ-активированную агрегацию нейтрофилов и спонтанную адгезию нейтрофилов с определением в них концентрации IL-1b и IL-8 и экспрессии L-селектина, ІСAM (CD-54),VCAM (CD-106) на поверхности клеток [10]. Активность iNOS и eNOS в плазме крови и лейкоцитах определяли по количеству нитрит-аниона, образующегося после инкубации методом Грина под влиянием реактива Грисса. Для определения активности индуцированной изоформы фермента вместо CaCl2 в среду вводили ЕДТА. Активность конститутивной изоформы рассчитывали как разницу между общей и индуцированной активностью [18]. АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов изучали фотоэлектроколориметрическим методом с определением чувствительности тромбоцитов к L-аргинину и S-нитрозоглутатиону in vitro [20]. Для лечения в соответствии со стандартами терапии больных ХБП применяли ингибиторы АПФ и блокаторы рецепторов к ангиотензину II, антагонисты кальция, бета-блокаторы; дезагреганты, гиполипидемические средства, антиоксиданты и антикоагулянты; донаторы и стимуляторы оксида азота

У всех умерших при жизни было проведено полное клиническое и биохимическое обследование, на основании которого верифицировали сахарный диабет и ишемическую болезнь сердца. По историям болезни были проанализированы характер клинического течения заболевания, наличие альбуминурии в анамнезе, результаты лабораторных исследований липидного и пуринового обмена.

Весь материал был разделен на три группы [1]. В первую группу вошел био­псийный материал почек 5 больных хроническим гломерулонефритом. Вторую группу составили фрагменты почек 9 умерших с сахарным диабетом легкой и средней тяжести. К третьей группе был отнесен аутопсийный материал почек 9 умерших с тяжелой формой течения сахарного диабета, у которых при жизни была диагностирована ДН с хронической почечной недостаточностью II-IV стадии и внепочечной патологией в виде ретинопатии, невропатии и диабетической стопы. Часть фрагмента почечной ткани фиксировали в 2,5% раствор глютарового альдегида и заливали в эпон-аралдит для изготовления полутонких срезов. Другая часть биопсийного материала была зафиксирована в 0,5% растворе параформа для постановки гистохимической реакции на NO-синтазу на криостатных срезах. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим для определения особенностей гистоструктуры почек и по методике Сато для выявления компонентов соединительной ткани. NO-синтазу определяли тетразолиевым методом [10] и оценивали путем цитоморфометрии в синем спектре света микроскопом Olympus BX41 с помощью программы Olympus DP-soft (version 3.1). Аутопсийный материал почек заключали в парафин, изготавливали серийные гистологические срезы, часть из которых окрашивали гематоксилин-эозином, а другую часть — на эластику по методике Вейгерта без дополнительных гистологических окрасок для выявления перитубулярных сосудов почки. Определение плотности распределения артерий, артериол и капилляров в ткани почек проводили на окрашенных по методике Вейгерта гистологических препаратах. Гистологические препараты исследовали и фотографировали под тринокулярным микроскопом Olympus BX41. Морфометрический анализ плотности распределения перитубулярных сосудов в ткани почки проводили с использованием программы Biovision 3.1. При морфометрическом анализе подсчитывали число сосудов в поле зрения микроскопа, площадь их просвета и среднее расстояние между ними при увеличении микроскопа х 200. Определение индекса плотности распределения крупных и мелких перитубулярных сосудов проводили по методике Г.Г. Автандилова (1990), статистическую обработку полученных метрических данных проводили по критерию Уитни — Манна — Вилкоксона с использованием пакета программ Statgraf 3.0.

Результаты исследования показали, что у четырех больных первой группы в нефробиоптатах определялись морфологические признаки хронического интракапиллярного гломерулонефрита, у пятого больного диагностирована экстракапиллярная форма гломерулопатии. Интракапиллярная гломерулопатия была представлена мембранозным гломерулонефритом различной степени выраженности. Морфологический анализ полутонких срезов показал, что в патологический процесс вовлечены практически все клубочки и их капиллярные петли. Поражение капиллярной сети клубочков характеризуется диффузным утолщением базальной мембраны без признаков пролиферации и воспаления. В отдельных случаях отмечается слабая очаговая пролиферация мезангия. По мере прогрессирования патологического процесса увеличивается число клубочков со склерозом капиллярных петель, между ними и внутренней поверхностью капсулы клубочка выявляются синехии. Эпителий канальцев почки находится в состоянии белковой и жировой дистрофии. Крупные и мелкие перитубулярные сосуды не поражены. Индекс плотности распределения крупных перитубулярных артерий составляет 7,8 ± 1,8, а мелких сосудов не превышает 3,8 ± 1,3.

Для больного хроническим экстракапиллярным гломерулонефритом было характерно наличие в клубочках почки фиброклеточных и фиброзных полумесяцев, выстилающих внутреннюю поверхность капсулы Шумлянского — Боумена. В капиллярных петлях клубочка выявляются фибриновые тромбы, участки фибриноидного некроза, которые приводят к коллапсу и склерозу капиллярных петель. Просвет канальцев резко расширен, содержит белковые и эритроцитарные цилиндры. Эпителий канальцев уплощен, находится в состоянии вакуольной и гиалиново-капельной дистрофии. Стенка крупных перитубулярных артерий не изменена. Мелкие сосуды полнокровны с признаками плазморрагии и диапедеза лейкоцитов, что сопровождается отеком интерстиция почки. Плотность распределения крупных перитубулярных сосудов ниже, чем при интракапиллярных гломерулонефритах, и индекс составляет 7,2 ± 1,2. Индекс плотности распределения мелких сосудов также ниже и не превышает 3,2 ± 1,1. Относительное снижение числа перитубулярных сосудов в данном случае можно объяснить нарастанием отека интерстиция и расширением просвета канальцевого аппарата, при которых сопровождающие сосуды раздвигаются и создается иллюзия «потери» сосудистого компонента.

Морфологические изменения в почках умерших пациентов второй группы касались всех структурных компонентов: клубочков, канальцев, артериол и артерий. Наиболее характерными были изменения гломерулярного аппарата клубочка в виде узелковых склеротических изменений капилляров. В стенке капилляров клубочка отмечались отложения эозинофильных гомогенных масс овальной формы, «замуровывающих» в себе мезангиальные клетки.

В ряде наблюдений узелки увеличены в объеме и занимают от 50 до 80 % площади капиллярной сети клубочка почки. Увеличиваясь в объеме, гиалиновые массы сдавливают прилежащие к ним капилляры, что приводит к полной облитерации клубочков и развитию капиллярного коллапса. Индекс плотности распределения для крупных сосудов составил 7,0 ± 0,2, для мелких артерий 3,0 ± 3,3 (p < 0,05) по сравнению с первой группой. В третьей группе умерших пациентов вследствие сдавления капилляров клубочков отмечается нарушение кровоснабжения тубулярного аппарата почки, что приводило к атрофии и гибели нефротелия канальцев и развитию хронического воспаления ткани, которое завершилось интерстициальным фиброзом. При IV стадии заболевания капилляры клубочков почти полностью замещаются соединительной тканью и липогиалиновыми массами.

Морфологически клубочки почек выглядят как гомогенные гиалиновые шары в прилегающей к ним интерстициальной ткани, на месте погибших канальцев выявляется массивная круглоклеточная инфильтрация. Индекс плотности сосудов в этой группе был достоверно ниже, чем в предыдущей, и составлял 4,7 ± 1,0 (p < 0,05). При этом склероз и гиалиноз крупных артерий приводили к запустеванию мелких перитубулярных капилляров и замещению их соединительной тканью. Индекс плотности распределения был крайне низким — 2,7 ± 1,1. Хотя, по мнению ряда авторов, экссудативные изменения не патогномоничны для ДН, тем не менее в двух наблюдениях умерших больных с CД в клубочках нефрона определялись «фибриновые шапочки», прилежащие к петлям капилляров. Отложение фибрина отмечалось и на внутренней поверхности капсулы клубочка. В этих случаях между петлями капилляров и внутренней поверхностью капсулы Шумлянского — Боумена образовывались тонкие синехии. Исходом экссудативного воспаления были утолщение стенки капсулы в виде полулуний и замещение капиллярной сети клубочков гиалином. Что касается изменений нефротелия, то в проксимальных извитых канальцах во всех наблюдениях они проявлялись гиалиново-капельной дистрофией и утолщением базальной мембраны.

Просвет канальцев, как правило, расширен и заполнен эозинофильным материалом с примесью слущенного эпителия. Морфологические изменения почечных сосудов в исследуемом материале служат ярким проявлением развития микро-, макроангиопатии. У умерших больных СД поражены как капилляры клубочков, так и артериолы и крупные почечные артерии.

Полученные нами данные о наличии эозинофильного материала в стенке капилляров клубочка при ХБП согласуются с данными M. Mayranpaa et al. (2006), которые показали, что в развитии эрозий человеческой коронарной артерии большую роль играет наличие в местах повреждения эндотелия тучных клеток и нейтрофилов, которые определялись в интиме сосудов в отношении 5 : 1. Авторы продемонстрировали, что воздействие на коронарные артерии рекомбинантной человеческой химазой, триптазой и катепсином G индуцировало повреждение эндотелия путем расщепления VE-кадгерина и фибронектина, необходимых для межклеточного взаимодействия [7]. Представленные нами данные свидетельствуют о том, что в последующем стенки артериолы почек замещаются гиалиноподобным материалом — сначала гиалин откладывается во внутренней трети стенки сосуда, а затем и во всей стенке артериолы, замещая гладкомышечные клетки. В клубочках нефрона гиалинизации подвергаются как афферентные, так и эфферентные артериолы, а также сосуды, кровоснабжающие почечные канальцы. Как показали результаты исследования, гиалинизация стенок артериол приводит к сужению их просвета и развитию артериолосклероза, однако в отличие от классического артериолосклероза при артериальной гипертензии при диабетической нефропатии развитие патологического процесса не зависело от уровня артериального давления.

Морфологические изменения в нефроне нашли свое отражение в нарушении NO-синтазной функции клеток почечной ткани. Так, по мере прогрессирования ХБП NADPH-диафоразная активность эндотелия клубочков и эпителия канальцев снижалась независимо от нозологической формы болезни до практически полного ее отсутствия при тяжелой ХПН, сохраняясь в какой-то мере в приносящей и выносящей артериолах. Наиболее выраженные проявления тетразолиевой реакции наблюдались в стенках приносящей и выносящей артериол, сосудах микроциркуляторного русла, где отмечались отложения гранул формазана синеватого цвета, что, по всей видимости, соответствует локализации именно эндотелиальной фракции синтазы оксида азота. По мере прогрессирования патологического процесса, который подтверждается склеротическими изменениями в аналогичных участках серийных срезов, отмечается снижение NADPH-диафоразной активности, что характеризуется сменой гранул формазана на его игольчатые отложения. Аналогичные изменения характерны в целом для всего микроциркуляторного русла, а не только для приносящей и выносящей артериол. Одновременно происходит некоторое усиление диафоразной активности на участках, соответствующих местам скоплений лейкоцитарных элементов. В большинстве препаратов почек, взятых при наиболее тяжелых формах ХБП, максимальная активность тетразолиевой реакции наблюдалась именно в таких зонах, при наличии лишь игольчатых включений формазана по ходу сосудов канальцев. Последнее может свидетельствовать об активации индуцибельной NO-синтазы на фоне снижения синтеза ее эндотелиальной фракции.

При болезнях почек имеется широкий спектр гистологических структур, которые могут принимать участие в имммуноопосредованных механизмах повреждения. Известно, что важную роль в инициировании повреждения почек и прогрессировании почечного фиброза играют макрофаги [5]. Мы попытались изучить взаимосвязь между плотностью капилляров, наличием макрофагов и активностью NOS в тканях и лейкоцитах почек пациентов с начальными и выраженными признаками ХБП. Главный результат исследования состоит в том, что у больных ХБП в почках выявлена ассоциация между капиллярной плотностью, лейкоцитарной инфильтрацией и NO-синтазной активностью почечной ткани. В продолжение предыдущей нашей работы о механизмах развития эпителиально-мезенхимальной трансформации у больных ХБП [3] в настоящей работе показана роль уменьшения количества капилляров в развитии нарушения кровообращения в почках.

По нашим данным, снижение суммарной активности NOS в почках у больных ХБП различного генеза носит однонаправленный, но избирательный характер. При этом активность NOS в сосудистой сети и макрофагах выше, чем корковом слое и канальцевом аппарате почек. Эти результаты согласуются с наблюдениями, полученными на культивируемых человеческих канальцевых эпителиоцитах: стимуляция iNOS приводила к активацию тирозинкиназы, включая JAK2, PKC, p38 MAPK и NF-кB, при экспозиции со смесью цитокинов IFN-γ, IL-1β и ФНО-α [9]. Мы полагаем, что стимуляция цитокинами может быть инициатором индукции и поддержки уровня экспрессии iNOS почечными клетками при ХБП. Потребление кислорода макрофагами при этих процессах может усилить гипоксию, так как множество секреторных молекул, вырабатываемых в макрофагах, способствует гипоксическим условиям. Настоящая работа показала, что наряду с прогнозируемым снижением экспрессии NOS эндотелиальными клетками в эпителиоцитах сохранялась незначительная активность суммарной NOS с кортико-медуллярным градиентом, что было подтверждено наличием активности NADPH-диафоразы на срезах паренхимы. Связь между капиллярной плотностью и наличием эозинофильно-макрофагальной инфильтрации, по нашим данным, предполагает доминирующую роль клеток белой крови и iNOS в инициации повреждения тканевых структур почек с развитием в них фиброзирующих процессов и нарушением оксигенации ткани на клеточном уровне. В проведенном исследовании гипоксия не могла быть оценена непосредственно, поэтому в качестве доказательств усиления гипоксии почек при более выраженной стадии заболевания использовалась иммуногистохимия с оценкой капиллярной плотности в комбинации с косвенными маркерами гипоксии ткани — наличием активности NOS в резидуальных клетках почек и крови. По-видимому, при длительном течении заболевания, когда сегменты нефрона сморщиваются, ишемия становится доминирующим фактором в стимуляции макрофагальной инфильтрации и пролиферации на этих участках. На этом этапе развития болезни неясно, может ли протеинурия сохранять свою патогенную значимость для прогрессирования болезни — по нашим данным, у 21 % пациентов с ДН со скоростью клубочковой фильтрации менее 60 мл/мин потеря белка с мочой отсутствовала [3]. Для ответа на эти вопросы необходимы более точные методы определения гипоксии ткани и ее влияния на различные типы клеток в почках.

Выводы

1. Для ХБП характерно уменьшение количества капилляров, которое приводит к ишемии, усилению инфильтрации почек лейкоцитами и дальнейшему прогрессированию болезни.

2. У больных ХБП отмечается разобщение активности NO-синтаз в почках со снижением активности их эндотелиальной фракции в стенках артериол и микроциркуляторных сосудах, с относительным увеличением их активности в зонах локализации лейкоцитарных элементов.

3. Нарушение морфологической структуры клубочков с преимущественным сужением отводящей артериолы и редуцированием перитубулярного кровотока, сопровождаемое снижением активности эндотелиальной NO-синтазы, приводит при ХБП к интраренальной гемодинамической несогласованности и ишемическому повреждению почек.