Международный неврологический журнал 2 (40) 2011

Мышечную усталость определяют как неспособность выполнять физическую нагрузку, которая успешно выполнялась до этого, неспособность генерировать требуемую или ожидаемую мощность/силу, что приводит к снижению физических возможностей, или как временную утрату способности делать усилие после только что прекратившейся мышечной работы [12, 16, 34].

Этиология мышечной утомляемости до конца не известна. Много факторов вовлечено в этот процесс, и относительная важность каждого из них зависит от состава мышечных волокон, интенсивности, типа и длительности сокращения, физической подготовки человека [30]. Некоторые из этих факторов включают быстрое истощение запасов гликогена и глюкозы [8, 18], накопление катаболитов, таких как молочная кислота [23], повышение содержания ионов Н+ и Pi (неорганического фосфата. — Прим. перев.) [14, 29, 32, 34, 37], неспособность поддерживать продукцию АТФ на скорости, достаточной для удовлетворения энергетических потребностей [14, 15, 32], увеличение скорости потребления кислорода, приводящее к развитию оксидативного стресса и повреждению тканей [3, 8, 20, 24, 35], недостаточное высвобождение ионов Ca2+ из саркоплазматического ретикулума [2, 15]. Все эти факторы по отдельности или в комбинации снижают способность выполнять физическую нагрузку при развитии усталости. Было показано, что гликоген мышц и глюкоза плазмы крови являются первичным источником энергии во время умеренной и тяжелой длительной физической нагрузки. В исследованиях, выполненных на собаках, было выяснено, что после обильного приема пищи, содержащей углеводы, животные были способны бежать на тредмиле в два раза дольше без признаков усталости и что физическая нагрузка вызывает увеличение транспорта глюкозы в мышцы [6, 9]. В исследованиях у людей было продемонстрировано, что употребление глюкозы (в том числе в жидком виде) во время физической нагрузки улучшает ее выполнение. Это свидетельствует о том, что углеводы могут отсрочивать развитие усталости во время длительного выполнения физической нагрузки, но не могут полностью предотвратить ее развитие [10, 17]. Было сообщено также об изменении активности ферментов и связывающих взаимодействий в мозге, печени и мышцах рыб при выполнении физической нагрузки. Эти изменения зависят от интенсивности физической нагрузки [26].

Нуклеотиды по типу цитидинмонофосфата (ЦМФ) и уридинмонофосфата (УМФ) обычно назначают пациентам с нейромышечными нарушениями, такими как невралгия, неврит и миалгия. Как следствие, наблюдается восстановление нарушенных неврологических функций, ослабление боли и улучшение двигательных функций после значительного мышечного напряжения, мышечных судорог или бега. Однако до сих пор не опубликованы работы, в которых эти данные были бы освещены с биохимической точки зрения. Клинический опыт свидетельствует о вовлечении в эти процессы нервной системы, однако метаболиты мышц и крови также могут иметь определенное значение. Было бы хорошо, если бы введенные извне нуклеотиды ЦМФ и УМФ защищали от повреждения или восстанавливали повреждения, вызванные повышенной продукцией молочной кислоты во время физической нагрузки, устраняя боль и улучшая двигательную функцию, или если бы ЦМФ и УМФ оказывали влияние на метаболизм, увеличивая поступление энергии к мышцам. Нуклеотид УМФ является предшественником молекулы уридинтрифосфата (УТФ) и является скорость-лимитирующим фактором при синтезе гликогена. УТФ + глюкозо-1-фосфат ® образование УДФ-глюкозы, которая является донором молекулы глюкозы при синтезе гликогена (УДФ-глюкоза + гликогенn ® гликогенn + 1 + УДФ). Следовательно, весьма вероятно, что введение УДФ стимулирует синтез гликогена и увеличивает запасы глюкозы у крыс. С другой стороны, нуклеотид ЦМФ стимулирует регенерацию нервных и мышечных волокон за счет стимуляции образования ЦДФ-холина и, как следствие, усиления биосинтеза фосфатидилхолинов [31, 36].

С целью выявления положительных эффектов от введения ЦМФ и УМФ у животных, выполняющих физическую нагрузку, мы оценивали время, за которое у них развивалась усталость во время бега по тредмилу. Мы также определили концентрацию различных метаболитов в мышцах и крови, например продукцию молочной кислоты, истощение запасов глюкозы и гликогена, каталитическую концентрацию креатинкиназы (КК, номер в соответствии с интегрированной базой данных ферментов (IntEnz) EC 2.7.3.2) и гликолитических ферментов, таких как лактатдегидрогеназа (ЛДГ, EC 1.1.1.27) аспартатаминотрансфераза (АСТ, EC 2.6.1.1).

Материалы и методы

Животные и экспериментальные группы. В настоящем исследовании использовали крыс линии Sprague Dawley (Harlan Iberica S.L., Испания) весом 275 ± 25 г. Крыс содержали при комнатной температуре 20 ± 2 °С и относительной влажности 50 ± 10 %. Длительность режима «день/ночь» составила 12 ч/12 ч. Крысам давали специальные пищевые гранулы (BK, Испания) и воду ad libitum (лат.: неограниченно, по желанию, сколько угодно. — Прим. перев.). Крыс случайным образом разделили на две экспериментальные группы: тех, которые получали нуклеотиды (леченые крысы, ЛК; n = 23), и тех, которые их не получали (нелеченые крысы, НК; n = 23). Все манипуляции и лечение были выполнены в полном соответствии с положениями об уходе за животными и использовании их в экспериментальных целях, принятыми в Европейском Союзе.

Подготовка препарата и его введение. Препарат нуклео ЦМФ форте вводили животным внутримышечно в дозе 5,5 мг/кг массы тела (3,0 мг/кг УМФ; 2,5 мг/кг ЦМФ). В соответствии с результатами экспериментов по подбору доз, выполненных фармацевтической компанией Grupo Ferrer (Испания), эта доза соответствовала максимальной из тех, введение которых не приводит к развитию токсических эффектов. Препарат растворяли в 2 мл 0,9% раствора NaCl и вводили крысам ежедневно в течение 10 дней подряд. Другой группе крыс внутримышечно вводили эквивалентный объем 0,9% раствора NaCl (без препарата).

Физическая нагрузка, предъявляемая крысам. В течение одной недели до начала эксперимента крысам назначали короткие режимы тренировок (10 мин/день) для того, чтобы они привыкли к тредмилу. Затем все крысы (ЛК и НК) выполняли два различных протокола физической нагрузки. Первый протокол был предназначен для определения времени, в течение которого у крыс развивалась мышечная слабость. Каждый день в течение 10 дней через 30 мин и 1 ч после приема препарата все крысы выполняли физическую нагрузку в полностью закрытом тредмиле LE 8700 (Letica Scientific Instruments, Испания). Каждую крысу заставляли бежать на тредмиле (20,4 м/мин, наклон 7,5 %) до развития состояния истощения, после чего регистрировали соответствующее время. Истощение крыс определяли как неспособность бежать в темпе, задаваемом тредмилом, либо переворачиваться при помещении на спину, либо стоять на четырех лапах при помещении на живот. В последний день эксперимента крыс умерщвляли и забирали образцы крови, мышц задних конечностей и печени для последующего анализа.

Второй протокол был выполнен для того, чтобы оценить эффекты препарата у крыс (ЛК: n = 10, НК: n = 10) в течение первых пяти минут физической нагрузки. В течение 10 дней до выполнения этого протокола крысы ежедневно получали тестируемый препарат. На 10-й день были выполнены условия второго протокола: 5 ЛК и 5 НК были умерщвлены до начала бега, и для последующего анализа у них были взяты образцы мышц задних конечностей и печени; остальные 5 ЛК и 5 НК были умерщвлены спустя 5 мин бега на тредмиле (20,4 м/мин, наклон 7,5 %), и у них для последующего анализа были взяты такие же образцы.

Образцы крови и тканей. Животных вводили в состояние наркоза, размещая ватный тампон, смоченный в галотане, на область носа, после чего пунктировали сердце и забирали образцы крови. Собранную кровь сразу же центрифугировали при 6000 об/мин и 4 °С в течение 20 мин (Eppendorf instruments, Германия), затем отбирали плазму и замораживали при температуре –80 °С для последующего биохимического анализа. Для приготовления образцов тканей забирали приблизительно 1 г мышц задних конечностей и 2 г печени и гомогенизировали их в 3% (масса (г)/объем (мл) х 100 %) холодном 20 мМ трис-HCl буфере, рН 7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА, 1 мМ b-меркаптоэтанола и ингибиторы протеаз (фенилметилсульфонил фторид 1 : 100, пепстатин 1 : 1000, бестатин 1 : 1000 и лептин 1 : 1000). При этом для гомогенизации образцов мышечной ткани использовали гомогенизатор Polytron (Kinematica Ltd., Швейцария; позиция 5, в течение 20 с), а для гомогенизации образцов печени — ручной гомогенизатор. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования при температуре 4 °С в течение 13 мин при 12 500 g, после чего супернатант отбирали и сохраняли при температуре –80 °С для последующего биохимического анализа. Мышечную ткань забирали достаточно быстро, чтобы предотвратить накопление в ней молочной кислоты после смерти животного.

Биохимический анализ. Каталитическую концентрацию лактатдегидрогеназы, креатинкиназы и аспартатаминотрансферазы определяли с помощью коммерческих наборов Roche Diagnostics (Mannheim, Германия). Концентрацию гликогена в тканях определяли по методу, описанному в работе [1]. После гидролиза гликогена с помощью перхлорной кислоты концентрацию глюкозы определяли флюорометрически [25]. Концентрацию молочной кислоты определяли с помощью ферментного колориметрического метода, предложенного Linear Chemicals (Badalona, Испания). Концентрацию белка оценивали по методу, предложенному в работе [7], с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Статистический анализ. В настоящей работе данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка. Статистический анализ был выполнен с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) при уровне значимости p ≤ 0,05. При выявлении общего достоверного эффекта для оценки значимых различий между отдельными группами использовали апостериорный критерий Ньюмана — Кеулса. Весь статистический анализ был выполнен с помощью программы GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software, США).

Результаты

Среднее время, через которое у леченых и нелеченых крыс развивалась усталость при беге по тредмилу в каждый из 10 дней, представлено на рис. 1. В течение первых шести дней эксперимента время, затрачиваемое на достижение мышечной слабости, увеличивалось одинаково в обеих группах животных. Однако, начиная с седьмого дня, леченые животные бежали больший интервал времени по сравнению с нелечеными животными (p ≤ 0,05). На 10-й день после завершения бега крыс умерщвляли, у них забирали образцы крови, печени и мышечной ткани так, как описано выше (см. раздел, посвященный материалу и методам исследования). В плазме крови леченых и нелеченых крыс не было обнаружено достоверных различий при сравнении средних значений глюкозы (соответственно 10,6 ± 0,9 мМ и 11,0 ± 0,9 мМ), молочной кислоты  (1,7 ± 0,3 мМ и 1,8 ± 0,1 мМ), ЛДГ (278 ± 60 Е/мл и  242 ± 37 Е/мл), КК (208 ± 44 Е/л и 207 ± 23 Е/л) и АСТ (95,9 ± 5,1 Е/л и 82,1 ± 8,0 Е/л). В табл. 1 представлены средние значения глюкозы, гликогена, лактата, ЛДГ и АСТ в образцах печени леченых и нелеченых крыс. Каталитическая концентрация ЛДГ была достоверно ниже у леченых крыс по сравнению с нелечеными (на 53 %,  p ≤ 0,05). Менее выраженные, но также достоверные различия наблюдались в отношении каталитической концентрации АСТ, которая была снижена в группе леченых крыс по сравнению с нелечеными (на 30 %, р ≤ 0,05). Средние значения глюкозы, лактата и гликогена в образцах мышечной ткани (табл. 1) достоверно не различались между группами леченых и нелеченых крыс. Это свидетельствует о том, что развитие усталости у нелеченых крыс не было связано с большим истощением запасов гликогена по сравнению с лечеными крысами.

Для того чтобы оценить эффекты препарата в первые 5 мин физической нагрузки, мы определили концентрацию глюкозы, гликогена и лактата в образцах печени (рис. 2) и мышечной ткани (рис. 3) леченых и нелеченых крыс до физической нагрузки и спустя 5 мин после ее начала. Результаты, представленные на рис. 2А, свидетельствуют о том, что концентрация глюкозы в печени после выполнения нагрузки достоверно увеличивалась в обеих группах (p ≤ 0,05), однако увеличение было более низким в группе леченых крыс по сравнению с нелечеными (33,3 и 46,3 % соответственно). Содержание гликогена в печени достоверно не различалось у леченых и нелеченых крыс до и после выполнения нагрузки (рис. 2Б). Как следует из рис. 2В, концентрация молочной кислоты в печени достоверно увеличивалась спустя 5 мин физической нагрузки только в группе нелеченых крыс (6,2 ± 1,4 мкмоль/г по сравнению с 3,9 ± 1,0 мкмоль/г, p ≤ 0,05). Это свидетельствует о том, что в течение первых 5 мин физической нагрузки у леченых крыс не образуется так много лактата, как у нелеченых крыс.

Концентрация глюкозы в мышцах была достоверно выше у леченых крыс по сравнению с нелечеными до и после физической нагрузки (рис. 3А), причем достоверное снижение содержания глюкозы в обеих группах крыс после нагрузки отсутствовало. Содержание гликогена в мышцах до физической нагрузки (рис. 3Б) было одинаковым у леченых и нелеченых крыс (38,2 ± 9,0 мкмоль/г и 37,5 ± 6,0 мкмоль/г соответственно), а спустя 5 мин после физической нагрузки оно немного (недостоверно) снижалось (30,3 ± 7,0 мкмоль/г и 29,0 ± 7,0 мкмоль/г). Содержание молочной кислоты в мышцах было одинаковым у леченых и нелеченых крыс до и после выполнения 5-минутной физической нагрузки (рис. 3В).

Обсуждение

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что крысы, получавшие в течение 10 дней ЦМФ/УМФ, были способны бежать на тредмиле более долгое время до развития физического истощения. Этот эффект был виден начиная с 7-го дня приема препарата, что свидетельствует о способности ЦМФ/УМФ во время физической нагрузки менять протекание аэробных механизмов в большей степени, нежели анаэробных. Мы определили концентрацию метаболических субстратов и ферментов, активирующихся во время физической нагрузки, чтобы ответить на вопрос, могут ли подобные метаболические изменения объяснить большую выносливость к нагрузке у леченых крыс.

Для индукции усталости у крыс был выбран бег на тредмиле, а не плавание, поскольку последний метод вызывает и другие формы стресса, например респираторный стресс, что ведет к высокой вариабельности аэробного ответа. Бег на тредмиле является стандартной формой аэробной физической нагрузки, используемой в экспериментах на животных и при исследованиях человека [5, 6, 9, 24].

В соответствии с первым протоколом эксперимента крыс заставляли бежать до достижения усталости или истощения. В этих условиях все биохимические показатели, оцененные в плазме леченых и нелеченых крыс, были одинаковыми. Эти результаты аналогичны тем, которые приводились и в более ранних исследованиях [13, 19, 33]. Ряд авторов сообщали об отсутствии изменений среди ферментов плазмы крови до и после бега на тредмиле у людей [5] и об отсутствии взаимосвязи между повышением каталитической концентрации КК в плазме крови и мышечным напряжением и слабостью [27]. Наши наблюдения подтверждают тот факт, что метаболические изменения, определяемые в тканях после физической нагрузки, если они присутствуют, не всегда выявляются в плазме крови. Возможно, это связано с тем, что физическая нагрузка не вызывает значительного повреждения тканей. У леченых крыс, которые бежали на тредмиле до развития истощения, каталитическая концентрация ЛДГ и АСТ в печени была значительно снижена, а концентрация глюкозы в мышечной ткани была немного повышена. Это свидетельствует о том, что у крыс, получавших ЦМФ/УМФ, наблюдалась чуть более высокая концентрация свободной глюкозы в мышцах, и о том, что они были способны лучше использовать эту глюкозу. Возможно, что ЦМФ и УМФ активируют окислительные ферменты и, при возрастании энергетических потребностей, глюкоза метаболизируется до АТФ в цикле Кребса, а не за счет образования молочной кислоты, вследствие чего каталитическая концентрация ферментов, ответственных за продукцию молочной кислоты, снижается, о чем свидетельствуют результаты нашего исследования. Низкая каталитическая концентрация ЛДГ может быть связана со снижением синтеза данного фермента, что может являться результатом угнетения соответствующих генов.

Наши результаты свидетельствуют о том, что концентрация гликогена в печени и мышцах была одинаковой у леченых и нелеченых крыс. Это говорит о том, что за более длительный период времени, в течение которого леченые крысы достигали состояния усталости, не происходило более выраженное истощение запасов гликогена. Полученные результаты могут быть объяснены исходя из предположения, что к тому моменту, когда животные достигают состояния усталости, весь доступный гликоген и глюкоза используются, вследствие чего в обеих группах животных наблюдаются одинаковые значения данных показателей. Поэтому мы разработали второй протокол физической нагрузки, где крысы бежали 5 мин, а биохимические показатели измеряли до и после выполнения этой нагрузки. В ходе этой части исследования до выполнения физической нагрузки было обнаружено, что у крыс, получавших ЦМФ и УМФ, была значительно повышена концентрация глюкозы в мышцах по сравнению с нелечеными животными. Возможное объяснение этого факта сводится к тому, что у крыс, получавших ЦМФ/УМФ, развивается особое адаптационное состояние, которое позволяет им накопить большее количество глюкозы в мышцах и, следовательно, переносить большие физические нагрузки [21, 28]. Одним из путей, усиливающих поступление глюкозы в клетки, является повышение содержания глюкозных транспортеров, присутствующих в клеточных мембранах, например семейства GLUT [22]. Нам также удалось обнаружить, что после выполнения 5-минутной физической нагрузки концентрация глюкозы в печени повышалась в обеих группах. Это указывает на то, что во время нагрузки наблюдается деградация гликогена в печени, с повышением содержания свободной глюкозы в этом органе, что было видно в группе нелеченых крыс. Кроме того, полученные результаты дают повод думать о том, что во время физической нагрузки нуклеотиды ЦМФ/УМФ поддерживают концентрацию гликогена в печени на постоянном уровне либо за счет того, что крысы способны быстро синтезировать гликоген при избытке УДФ-глюкозы, либо за счет снижения скорости деградации гликогена вследствие избытка глюкозы в мышечной ткани.

Во время выполнения физической нагрузки весьма ожидаемым является увеличение продукции и накопления молочной кислоты, поскольку возникает необходимость в быстрой деградации глюкозы с целью получения энергии, требуемой мышцам [11, 12, 26, 35]. В нашем исследовании этот феномен наблюдался в ткани печени нелеченых крыс, но не в мышцах. Отсутствие повышения содержания молочной кислоты в мышцах и печени леченых крыс спустя 5 мин физической нагрузки может объяснить отсутствие мышечной боли и слабости у леченых животных при беге на тредмиле (до развития утомления). Механизм этого феномена точно не известен, однако предполагалось, что нуклеотиды урацила могут присутствовать в синаптических пузырьках и высвобождаться при стимуляции нервов [4]. Растет количество данных о том, что выделяемые нуклеотиды урацила активируют свои рецепторы, вовлеченные в сигнальные механизмы в клетках, что может иметь значение для развития их фармакологического эффекта.

В заключение необходимо отметить, что введение нуклео ЦМФ форте может способствовать предотвращению развития усталости и мышечных судорог у крыс. Однако необходимо проводить дальнейшие исследования для того, чтобы подтвердить эти данные и прояснить механизм действия экзогенно вводимых УМФ и ЦМФ у людей.

Оригинал статьи опубликован  в Journal of Physiology and Biochemistry. — 2008. — Vol. 64, № 1. — 9-17