Газета «Новости медицины и фармации» 7(211) 2007

На протяжении последних лет асфиксия занимает одно из видных мест в структуре перинатальной заболеваемости и остается одной из главных причин перинатальных поражений центральной нервной системы (ЦНС) плода и новорожденного, смертности и инвалидизации и имеет огромное влияние на дальнейшее развитие ребенка, качество его жизни. В течение последних лет показатели заболеваемости асфиксией в Украине остаются стабильно высокими и составили в 2003 году 91,11 %, в 2004 г. — 73,98 %, в 2005 г. — 72,4 %.

Поэтому целью нашего исследования было ретроспективно оценить нервно-психическое и физическое развитие детей, которые перенесли перинатальную асфиксию, исследовать некоторые особенности энергетического обмена нейроцитов при умеренной и тяжелой асфиксии в эксперименте и отработать модель неврологического наблюдения за новорожденными для раннего выявления гипоксических повреждений ЦНС.

Материалы и методы

Программа исследования включала три этапа. Первый — катамнестическое исследование неврологического статуса и состояния здоровья новорожденных детей, которые перенесли перинатальную асфиксию, с расчетом относительных показателей связи перинатальных факторов риска с группой здоровья. Второй этап — экспериментальный, поскольку исследования на животных разрешают получить информацию, которую невозможно получить любым другим путем, в нашем случае это новые данные, которые касаются механизмов развития пре- и патологических изменений в энергообмене нейроцитов крыс. Третий этап — апробация и внедрение шкалы NNNS (Neonatal Intensive Care Unit Network Neurobehavioral Scale) нейроповеденческого развития грудных детей, получавших интенсивную терапию, которая предоставляет возможность воссоздавать ее разными врачами, нивелируя субъективный фактор, не нуждается в дорогом оборудовании и разрешает количественно оценить динамические и качественные изменения в состоянии ребенка.

Для достижения цели нами был проведен ретроспективный анализ 197 историй болезни доношенных детей с перинатальной асфиксией, которые лечились в отделениях интенсивной терапии г. Полтавы и Кременчуга, и амбулаторных карт развития этих детей на протяжении шести лет (2000–2005 гг.).

Экспериментальная модель гипоксии была воспроизведена по методике, адаптированной в отделе изучения гипоксических состояний (по уровню РаО₂ крови) Института физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины. Идентификацию процессов, которые изучались, осуществляли с помощью программы UTHSCSA Image Tool — Version 3.0 (Texas, США) на основе подсчета количества митохондрий, процента поврежденных митохондрий, их диаметра. По морфометрической методике определяли сумму поверхностей митохондрий, связанную с энергетической способностью органелл [3].

Исследование было проведено на 9 крысах (самки) и их 56 крысятах с массой 30–35 г. Животные были распределены на сравнительную и исследуемую группы. Сравнительная группа животных (n = 20) была, в свою очередь, распределена на 3 подгруппы. Первую подгруппу составили интактные животные (n = 8), во вторую подгруппу вошли крысята, которые испытали действие умеренной гипоксии (n = 6), в третью (n = 6) — действие тяжелой гипоксии. Исследуемая группа, в свою очередь, была распределена на такие подгруппы по шесть животных в каждой: крысята, которые получали липин при условии действия умеренной гипоксии (ІV подгруппа) и тяжелой гипоксии (V подгруппа); крысята, которые получали Цереброкурин^® при условии умеренной гипоксии (VІ подгруппа) и тяжелой гипоксии (VІІ подгруппа); крысята, которые получали липин и Цереброкурин^® одновременно при условии умеренной гипоксии (VІІІ подгруппа) и тяжелой гипоксии (ІХ подгруппа).

Цереброкурин^® — препарат, который содержит комплекс свободных аминокислот, пептидов и низкомолекулярных продуктов контролируемого протеолиза белков головного мозга эмбрионов крупного рогатого скота, генотип которых индифферентен к генотипу реципиента человека. Липин — препарат естественного происхождения, который представляет собой лиофилизированный яичный лецитин и имеет антигипоксическое действие, ингибирует перекисное окисление липидов, предупреждает снижение энергетического метаболизма клеток [6–8]. Указанные препараты крысята получали в месячном возрасте. Цереброкурин^® — трижды с интервалом в 1 день внутримышечно по 0,001 мл на животное и липин — ежедневно на протяжении 5 дней внутривенно по 2,5 мг на 100 г массы тела.

Исследование неврологического состояния оценивалось по неврологической, поведенческой и стрессовой составной шкалы NNNS [1].

Результаты и их обсуждение

Ретроспективное исследование выявило, что среди детей, которые перенесли тяжелую и умеренную асфиксию, 159 имели І и ІІ группы здоровья, 38 детей — ІІІ–V группы. Анализ перинатального анамнеза с расчетом коэффициента соотношения шансов (КСШ), который в нашем случае свидетельствует о возможной связи между действием какого-то перинатального фактора и нарушением состояния здоровья ребенка, выявил следующее. Наличие у матери во время беременности угрозы прерывания беременности (КСШ = 1,4), токсикоза (КСШ = 0,62), анемии (КСШ = 0,99), фетоплацентарной недостаточности (КСШ = 0,59), многоводья (КСШ = 0,36), кольпита (КСШ = 1,05) не влияет на будущее состояние здоровья ребенка. Более детальный анализ факторов риска хода родов выявил такие закономерности: первые роды у матери (КСШ = 1,34), слабость родовой деятельности (КСШ = 1,05), операция кесаревого сечения (КСШ = 0,95), наложение щипцов (КСШ = 0,57), преждевременное отхождение околоплодных вод (КСШ = 0,85), обвитие пуповины вокруг шеи ребенка (КСШ = 0,92), преэклампсия (КСШ = 0,62), то есть эти особенности родовой деятельности не влияют на дальнейшее развитие ребенка. В то же время стимуляция родовой деятельности (КСШ = 3,19), отслоение плаценты (КСШ = 6,72) существенно повышают шансы ребенка иметь хронические заболевания. Оценка по шкале Апгар < 3 баллов на 1-й минуте (КСШ = 2,11), тяжелая асфиксия (КСШ = 2,43), наличие патологических движений глаз (КСШ = 2,34) выявили возможную вероятность отнести ребенка к ІІІ–V группам здоровья. В то же время масса при рождении свыше 4 кг (КСШ = 1,66), искусственное вскармливание (КСШ = 0,55), проведение ШВЛ в ранний неонатальный период (КСШ = 1,5), наличие синдрома угнетения (КСШ = 0,27) и судорог (КСШ = 0,55) не имели существенного влияния на дальнейшее развитие ребенка.

Таким образом, наше исследование выявило, что сейчас не существует доступных критериев прогнозирования дальнейшего развития грудных детей, то есть невозможно оценить значение гипоксического влияния на ребенка лишь по особенностям перинатального онтогенеза, оценке по шкале Апгар и наличию неврологических симптомов. Причиной этого, вероятно, являются индивидуальная чувствительность ЦНС новорожденного к гипоксии и значительные компенсаторные механизмы у грудного ребенка. В связи с этим нами были проведены экспериментальные исследования по изучению особенностей энергообмена нейроцитов крыс на фоне хронической гипоксии.

Как показало исследование, у крысят ІІ подгруппы происходит увеличение максимального диаметра митохондрий в среднем на 70 %, у крысят ІІІ подгруппы — более чем в 2 раза. Такие изменения, которые принято считать необратимым набуханием, тесно связаны с гибелью митохондрий, тем более что происходило резкое увеличение диаметра параллельно с вакуолизацией и деструкцией. Нужно обратить внимание на тот факт, что в нейроцитах крысят, которые испытали действие тяжелой гипоксии, уменьшение общего количества митохондрий достигает 1,8 раза, а уменьшение суммы их поверхностей происходит лишь на 18 %, то есть можно предположить, что кроме общего изменения количества органелл подавляющее большинство последних находилось именно в состоянии необратимого набухания и не способно было выполнять свои энергообеспечивающие функции. У животных же ІІ подгруппы соотношения количества митохондрий, их диаметра и суммы поверхностей имеют более оптимальный характер, а именно умеренный рост диаметров при практически стабильном количестве. Кроме того, у крысят ІІІ подгруппы отмечено достоверно большее количество митохондрий в стадии разрушения по сравнению с животными ІІ и интактной подгрупп, соответственно 17,0 % против 6,4 % у животных ІІ подгруппы (р < 0,05) и 2,1 % у крысят І подгруппы (р < 0,05). При этом в поврежденных митохондриях животных ІІІ подгруппы отмечается деструкция и дискомплексация крист, разрушение внутренней и/или внешней митохондриальных мембран, часто в органеллах сохранена только оболочка благодаря гидролизу остатков митохондрий или кое-где имеет место их инкапсуляция. С помощью электронно-микроскопических исследований нами выявлено наличие «структурного дистресса» митохондрий в клетках мозга у крысят ІІІ подгруппы. На фоне практического отсутствия юных форм митохондрий наблюдались все стадии гибели митохондрий — от отека до полного растворения, что подтверждает необратимость именно структурных изменений исследуемых органелл.

Наше исследование показало, что наилучшее коррегирующее действие в плане нормализации митохондриального аппарата, в частности количества митохондрий, наблюдается у экспериментальных животных, которые испытали действие умеренной гипоксии при применении у них Цереброкурина^® с липином. Так, количество митохондрий у животных VIІІ группы составило 23,3 ± 1,7 ед/мкм² против 13,6 ± 0,8 ед/мкм² у животных ІІ подгруппы (р < 0,05). Что касается количества поврежденных митохондрий, то наиболее выраженный эффект получен нами у животных, которые испытали действие тяжелой гипоксии на фоне применения Цереброкурина^®. В частности, применение данного препарата у этих животных достоверно уменьшило количество поврежденных митохондрий с 17 до 4,2 % (р < 0,05). Подобные изменения, констатированные и у животных, которые испытали действие умеренной гипоксии, уменьшились соответственно с 6,4 до 4,2 %. По нашему мнению, такие результаты можно объяснить тем, что при тяжелой гипоксии на первый план выходят нарушения микроциркуляции и перфузии головного мозга, приводящие к ухудшению обеспечения кислородом мозговой ткани, которое, в свою очередь, отрицательно влияет на состояние митохондриального аппарата клеток. Такие отрицательные изменения в определенной степени нормализует Цереброкурин^®. Исследование показало, что при условии действия тяжелой гипоксии на фоне применения Цереброкурина^® уменьшился диаметр митохондрий с 0,41 ± 0,02 мкм до 0,22 ± 0,05 мкм (р < 0,05) и приблизился к показателям интактных животных 0,20 ± 0,02 мкм (р ≥ 0,05). Нужно отметить, что увеличенный диаметр митохондрий сохраняется у крыс ІV и V подгрупп, то есть при применении липина (р < 0,05). Можно считать, что у животных VII и VIII подгрупп при нормализации диаметра митохондрий (соответственно 0,22 ± 0,05 мкм и 0,19 ± 0,03 мкм против 0,20 ± 0,02 мкм у животных интактной группы, р > 0,05) происходит также и нормализация (приближенная к контрольному уровню) энергообмена и мембранной проницаемости. Важно отметить, что применение Цереброкурина^® достоверно оказывает содействие в обновлении «конвейера митохондрий», начиная от юных форм и заканчивая деструкцией старых органелл.

Нами получена достоверно большая суммарная площадь митохондрий в единице объема ткани в группах животных, которые испытали действия тяжелой и умеренной гипоксии и получали Цереброкурин^® или в соединении его с липином (соответственно 4,6 ± 0,3 Si_tot, мкм²; 6,4 ± 0,8 Si_tot, мкм² и 5,2 ± 0,4 Si_tot, мкм²) сравнительно с животными, которые также испытали действие гипоксического влияния, но не получали эти препараты (р < 0,05). При применении липина у животных, которые испытали действие тяжелой гипоксии (V подгруппа), существенно уменьшаются проявления деструкции, а проявления отека встречаются редко. Нужно отметить, что применение липина во всех сериях исследования сопровождается: стабилизацией и уплотнением цитоплазматических и митохондриальных мембран; появлением митохондрий с везикулярными кристами, что свидетельствует об усилении их синтезирующей активности; усилением выработки миелина, а также нормализацией ультраструктуры эндотелия капилляров в случае его повреждения. При использовании Цереброкурина^® (VII подгруппа) у исследуемых животных наблюдается более выраженная реакция в выработке миелина.

Таким образом, проведенное исследование показало, что у крысят, которые испытали действие умеренной гипоксии до рождения, при практически неизменном общем количестве митохондрий наблюдается резкий возможный рост процента поврежденных органелл на фоне достоверного увеличения их диаметра и суммы поверхности митохондрий в единице объема. Интерполируя полученные экспериментальные данные на грудных детей, можно предположить, что описанные изменения митохондрий клинически могут не проявляться, но при действии стрессовых факторов, которые нуждаются в дополнительных энергозатратах, может развиться митохондриальный дистресс и срыв компенсации в функционировании нервной системы. В случае действия тяжелой асфиксии изменения энергетического аппарата нейроцитов носят необратимый характер, который очень опасен для дальнейшего развития ребенка.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости поиска адекватных маркеров оценки величины гипоксического влияния на ЦНС именно на ранних этапах восстановительного периода и оценки эффективности предложенных лечебных комплексов, направленных на возобновление конвейера митохондрий и соответственно нормализацию энергообмена нейроцитов мозга. То есть перед внедрением новых схем лечения и реабилитации грудных детей с гипоксическим поражением ЦНС необходимо было отработать схему клинического наблюдения за ребенком и адекватно оценивать эффективность предложенных методов лечения.

С этой целью мы применили модель оценки неврологического статуса с использованием шкалы нейроповеденческого развития грудных детей, которые получали интенсивную терапию. При оценивании трех составных шкалы, которую выражали в количественном эквиваленте, мы руководствовались нормальным распределением и определением М, доверительных интервалов и перцентилей [4]. По этой шкале мы оценивали: привыкание, внимание, спокойствие, сознание, коммуникабельность, качество движений, рефлексы, активный тонус, пассивный тонус, асимметрию, гипертонус, гипотонус, реакцию на стресс. Таким образом, было обследовано 15 грудных детей в течение 2 недель после рождения. Применение шкалы нейроповеденческого мониторинга позволило нам оценить ответ ребенка на стрессовые ситуации, выявить функциональные недостатки на ранних стадиях и конкретизировать сферу нарушений с дальнейшей разработкой индивидуально-реабилитационных мероприятий.

Выводы

1. По особенностям протекания беременности и родов невозможно четко предусмотреть изменения в дальнейшем неврологическом развитии ребенка.

2. Клинико-экспериментальное исследование выявило, что у крысят, которые испытали действие умеренной гипоксии до рождения, наблюдается достоверное увеличение диаметра и суммы поверхности митохондрий в единице объема в нейроцитах относительно данного показателя у интактных животных. У животных, которые испытали действие тяжелой гипоксии, констатировано наличие структурного дистресса митохондрий на фоне практического отсутствия юных форм митохондрий.

3. Одновременное использование Цереброкурина^® и липина у экспериментальных животных, которые испытали действие умеренной гипоксии, приводит к достоверному увеличению площади митохондрий в единице объема по сравнению с животными интактной группы. Во время тяжелого гипоксического поражения нейроцитов происходит мозаичное разрушение миелиновых оболочек, которые восстанавливаются при использовании Цереброкурина^®.

4. Нейроповеденческий мониторинг с применением шкалы NNNS на ранних этапах возобновляемого периода позволяет оценить выявленные функциональные недостатки и конкретизировать сферу нарушений с дальнейшей разработкой индивидуально-реабилитационных мероприятий.