Газета «Новости медицины и фармации» Офтальмология (363) 2011 (тематический номер)

Введение

В настоящее время лазерные технологии нашли широкое и разнообразное применение в медицине, с их помощью решаются задачи хирургии, терапии и диагностики. Однако существует группа методов, базирующихся на применении лазеров, которые до сих пор не получили достаточного распространения в медицине, — это голографические методы. Пионерские работы в этом направлении известны практически с момента возникновения голографии, однако широкого практического применения они не получили. Связано это с определенными техническими сложностями, присущими классической голографии. В настоящее время в связи с развитием методов динамической голографии, цифровой (телевизионной, компьютерной) голографии и близкого к ней метода фазомодулированной спекл-интерферометрии (Еlectronic Speckle Рattern Interferometry — ESPI) данные сложности во многом преодолены, что дает базу для нового витка развития медицинского применения голографических методов.

Медицинские применения голографии (и родственных методов) можно разбить на три большие группы по базовым методикам:

— классическая голография;

— цифровая голография и ESPI;

— создание голографических оптических элементов (ГОЭ), которые могут использоваться в медицинском оборудовании для формирования и преобразования оптических пучков.

НИИ физики ОНУ совместно с ГУ «Институт глазных болезней и тканевой терапии имени В.П. Филатова НАМНУ» и ГУ «Украинский научно-исследовательский противочумный институт им. И.И. Мечникова» на протяжении многих лет проводили работы в этих областях в рамках договоров о научно-техническом сотрудничестве. В данной статье дан краткий обзор результатов, полученных как в этих работах, так и в работах других коллективов, приведен анализ их возможного дальнейшего развития, а также создания принципиально новых приложений в области медицинской диагностики и терапии. Особое внимание уделено специфике применения голо­графических методов в офтальмологии.

Следует отметить, что применение голографических методик в хирургии также возможно и перспективно, например использование динамических ГОЭ для управления лучом лазерного скальпеля и формирования его оптимальной структуры, однако данная тематика требует отдельного рассмотрения.

Предупреждение: в данной статье не рассматривается тематика, связанная с предполагаемым голографическим переносом биологической информации (ключевые слова: голографическая терапия, энергоинформационное поле, голографический принцип строения живых организмов и Вселенной и т.д.). Авторы не считают себя достаточно компетентными в данной области.

1. Диагностическое  применение голографии

Возможности данного применения голографических методов наиболее обширны и очевидны.

1.1. Изобразительная голография

Классическая голография

Идея диагностического применения изобразительной голографии в офтальмологии базируется на способности голограмм восстанавливать точное объемное изображение предмета. Подробное микроскопическое исследование глаза (например, при помощи фундус-камеры) утомительно для пациента, кроме того, сильно осложняется непроизвольной моторикой глаза. Если получить голограмму глаза, то восстановленное с ее помощью объемное изображение будет точной копией оригинала (благодаря чрезвычайно высокой информационной емкости голограмм), и его можно не только подробно исследовать оптическими методами, но и сохранить в истории болезни.

В ранних работах данного направления, в частности в ГУ «Институт глазных болезней и тканевой терапии имени В.П. Филатова НАМНУ» совместно с НИИ физики ОНУ [1], использовались методы классической голографии (рис. 1).

Интерференционная картина, образовавшаяся в результате наложения объектной и опорной волн, регистрируется с помощью голографического светочувствительного материала (голографической пластины). Получившаяся после соответствующей обработки (проявления и фиксации) голограмма при освещении ее опорной волной восстанавливает в первом порядке дифракции объемное изображение объекта.

Полученные результаты были признаны обнадеживающими, однако это направление не получило практического применения. Причиной этого были следующие технические сложности:

1. Даже самые чувствительные (серебряно-галоидные) голографические регистрирующие материалы имеют крайне низкую светочувствительность, поэтому при регистрации голограммы лазерным излучением видимого диапазона велик риск повредить сетчатку глаза. Ограничение светочувствительности связано с тем, что голографические регистрирующие материалы должны иметь очень высокую разрешающую способность (1000–6000 линий/мм), и в настоящее время невозможно ее существенное увеличение. Возможным решением было бы использовать для регистрации голограмм лазерное излучение ближнего инфракрасного (ИК) диапазона, что подняло бы порог допустимых мощностей приблизительно на два порядка, но, несмотря на некоторые успехи в этой области [2], голографических материалов с достаточной ИК-чувствительностью еще не существует.

2. При регистрации голограммы объект должен быть абсолютно стабилен (с точностью до четверти длины волны), что для глаза возможно только при очень коротких экспозициях и, соответственно, очень высоких мощностях излучения. Применение же импульсного лазера дополнительно увеличивает риск повреждения сетчатки (при регистрации портретных голограмм обычной практикой является использование защитных контактных линз), поэтому в наших экспериментальных работах были использованы только изолированные глаза [1].

Цифровая голография

В настоящее время возможно дальнейшее развитие данного направления при помощи методов цифровой голо­графии. В данном случае распределение интенсивностей в интерференционной картине регистрируется при помощи ПЗС-матриц (телекамер), светочувствительность которых как в видимом, так и в ближнем ИК-диапазоне позволяет полностью решить проблему безопасности. 3D-изображение объекта рассчитывается компьютером и выводится на дисплей [3]. Такое изображение не является в полной мере объемным, зато легко интегрируется в современные информационные системы. Более того, в настоящее время активно разрабатываются компьютерно управляемые оптические 2D-фазовые модуляторы, применяемые для коррекции фазовой структуры волновых фронтов. Они при достижении достаточной разрешающей способности будут способны генерировать полноценное динамическое голографическое изображение. Эта технология также перспективна для наглядного 3D-представления данных различных видов томографии (рентгеновской, электронного парамагнитного резонанса, МРТ, оптической когерентной томографии — ОКТ).

Единственная причина, по которой данные технологии все еще являются экспериментальными или позволяют работать только с очень маленькими объектами, заключается в недостаточной разрешающей способности как современных телекамер, так и модуляторов. Для создания полноценных голографических систем разрешающую способность предстоит поднять как минимум на два порядка.

Тем не менее уже достигнутые технические параметры телекамер, фазомодуляционных систем и компьютеров позволили создать серийные образцы цифровых голографических микроскопов (например, безлинзовый микроскоп Numerical Vision LDHM-4).

Для создания офтальмологических цифровых голографических систем дополнительной сложностью является быстродействие телекамер, которое должно составлять не менее 10 000 кадров в секунду. В настоящее время такие камеры существуют, но их разрешение невелико (~1 мегапиксел), с увеличением разрешения данный параметр может стать проблемой. Впрочем, современная динамика развития специальных видеосредств вполне оптимистична.

1.2. Голографическая и спекл-­интерферометрия

Классическая голографическая  интерферометрия

Уникальной особенностью голо­грамм является то, что они способны восстанавливать не только объемное изображение предмета (объектную волну), но и точное распределение фаз в нем. На этом свойстве базируются методы голографической интерферометрии и микроскопии, являющиеся основой многих методов неразрушающего контроля и прецизионных измерений [4]. С их помощью можно измерить и оцифровать 3D-форму объектов (рис. 2), их деформацию, обнаружить вариации показателя преломления в прозрачных объектах и многое другое.

Данные методы могут быть полезны в офтальмологии. В работе [1] была продемонстрирована возможность применения методов голографической двухэкспозиционной интерферометрии для диагностики различных патологий глаза. Например, на рис. 2В показана интерферограмма фрагмента линейного дефекта (впадины поверхности) роговицы глаза кролика, представленного на рис. 1, и рассчитанный по ней профиль впадины.

До практического применения данные разработки доведены не были, причины чего уже описаны в пункте 1.1. Однако в настоящее время, с развитием цифровой голографии и ESPI-метода и осознанием их возможностей, данные работы можно и необходимо продолжить.

Спекл-интерферометрия.

ESPI-метод

Данный метод близок к методу цифровой голографии, однако значительно проще в реализации. Принципиальные оптические схемы установок представлены на рис. 3. Фактически они являются спекл-интерферометрами, подобными интерферометру Майкельсона для измерений в отраженном свете (рис. 3А) и Маха — Цандера в проходящем (рис. 3В).

Сущностью ESPI-метода является то, что в нем используются оптические пучки, имеющие специальную спекл-структуру. Она всегда формируется при когерентном (лазерном) освещении случайно рассеивающих или преломляющих объектов. В этом случае в рассеянном световом поле образуются спеклы (пятна), особенность которых заключается в том, что в пределах одного спекла амплитуда излучения меняется, но фаза остается постоянной. Поэтому в суммарном поле, образованном наложением объектного и опорного спекл-полей, интерференционная структура не формируется, но интенсивность отдельных спеклов меняется в зависимости от сдвига фазы опорного пучка (рис. 4).

Корреляционный анализ набора спеклограмм с различным фазовым сдвигом опорного пучка позволяет восстановить фазовую структуру объектной волны (создать фазовый портрет), т.е. решить задачу цифровой голографии, но с существенным упрощением. Можно сказать, что спекл усредняет оптическую информацию по площади, которую покрывает. Следовательно, при интерферометрическом исследовании спекл-полей в качестве регистрирующего устройства можно применять не голограмму, а телекамеру, пространственное разрешение которой должно соответствовать размерам исследуемых спеклов. Требуемое для ESPI разрешение существенно (на 2–3 порядка) ниже необходимого для цифровой голографии, а получаемые результаты сравнимы [5].

ESPI-метод позволяет реализовать все возможности голографической интерферометрии, в том числе двухэкспозиционной [6]. В последнем случае проводится дополнительная совместная корреляционная обработка двух фазовых портретов одного объекта, полученных до и после его изменения, например деформации. Полученные  таким образом картины корреляции фаз соответствуют классическим интерференционным картинам (рис. 5), с тем существенным преимуществом, что в отличие от интерферограмм направление увеличения или уменьшения фазы в них определяется однозначно.

Как видно на рис. 5, естественным недостатком ESPI-метода является неизбежная зернистость изображения, но это может быть преодолено как программными средствами (использованием методов интерполяции и экстраполяции), так и путем записи набора спеклограмм с пространственным сдвигом спекл-поля и последующим синтезом непрерывного изображения.

Медицинское применение ESPI- метода

Применение в офтальмологии

Для практических целей (лазерная хирургия глаза, изменение формы хрусталика глаза) очень важны методы определения формы роговицы глаза. Эта задача была решена ESPI-методом с дополнительной модуляцией длины волны лазерного излучения [7]. Данная модификация ESPI-метода заключается в том, что сравниваются два фазовых портрета поверхности тестируемого объекта, полученные при разных длинах волн лазерного излучения l1 и l2. В этом случае на картине корреляции фаз появляются эквифазные полосы, расстояние между которыми по глубине d равно d = l1l2 / 2Dl. Чувствительность метода регулируется изменением величины Dl и может составлять от микрон до сантиметров. Полученные результаты представлены на рис. 6.

Для той же цели может быть использован также иммерсионный метод [8]. В данной модификации второй фазовый портрет снимается после изменения показателя преломления среды, в которую помещается исследуемый объект, т.е. применения или смены иммерсионной жидкости. В этом случае перепад высоты между линиями d = l / 2Dn, где Dn — изменение показателя преломления иммерсионной жидкости. На рис. 7 показан профиль углубления (~ 0,1 мм), оставленного на прозрачном пластике шариком шариковой ручки, d составляет в данном случае 0,02 мм.

Не менее важно определение эласто-упругих свойств внешних оболочек глаза. В работе [9] было предложено использовать для этой цели ESPI-метод, но, на наш взгляд, в неудачной модификации. Предлагалось покрывать поверхность роговицы рассеивающим порошком, а в качестве тестирующего воздействия использовать изменение внутриглазного давления при помощи инъекции физиологического раствора NaCl (рис. 8А). Все это травматично для глаза.

Разработанный в НИИ физики ОНУ метод аналогичного назначения [10] лишен этих недостатков (рис. 8 В). В качестве тестирующего воздействия предложено использовать нетравматические для глаза факторы: изменение внешнего давления, механическое давление, воздушную струю, ультразвук, электрическое поле. На рис. 9 показаны картины корреляции фаз, полученные при последовательном увеличении внешнего давления. Видно, что деформация роговицы резко асимметрична.

Оптическая когерентная томография

Данный метод базируется на использовании низкокогерентных источников (полупроводниковых лазеров и суперлюминесцентных диодов), широко распространен в офтальмологии и позволяет решать важные задачи, например диагностировать отслоения сетчатки. Современные приборы позволяют как получать линейные сканы, так и работать в режиме картографирования (рис. 10). Но их работа связана со сканированием как в плоскости изображения, так и по глубине, что замедляет операцию исследования. Применение в данных приборах методов цифровой голографии и ESPI, не требующих сканирования, позволит существенно увеличить быстродействие приборов ОКТ.

 1.3. Голографическая микроскопия

Классическая голография

Существуют микроскопные установки, составной частью конструкции которых является ГОЭ, созданные по принципам классической голографии [12]. Задачей ГОЭ в них является создание фантомного объекта сравнения. Данные установки позволяют проводить исследования трехмерной морфологии и фазовой структуры микроскопических объектов. Недостатком данного направления является сложность реализации и то, что обслуживание данной установки может осуществлять только высококвалифицированный персонал.

Цифровая микроскопия

Данное направление наиболее разработано, существуют промышленно выпускаемые микроскопы и профилометры, использующие этот принцип. Практически единственный, но очень существенный их недостаток — высокая стоимость.

Спекл-микроскопия

Как уже сказано выше, возможности ESPI-метода практически те же, что и для классической и цифровой голографий, а местами и превышают их. В то же время он значительно проще (а соответственно, дешевле) в практической реализации.

Ниже приведены данные, полученные при помощи спекл-микроскопа, разработанного и созданного в НИИ физики ОНУ [12]. Методы, положенные в основу его работы, частично запатентованы [5, 7, 8]. В настоящее время в НИИ физики ОНУ ведутся работы по созданию ESPI-приставок к обычным оптическим микроскопам. Предполагается, что это позволит достичь практически таких же характеристик, как у специализированных устройств.

На рис. 11 представлены результаты исследования 3D-формы тестового объекта — капли масла на поверхности предметного стекла.

На рис. 12 представлены результаты по измерению 3D-формы эритроцита человека. Важность этого исследования состоит в том, что степень вогнутости эритроцита коррелирует с его насыщением кислородом [13].

Чрезвычайно полезно применение ESPI-микроскопа для определения состояния клеток, причем даже в живом состоянии, без какой-либо дополнительной обработки (окраски, фиксации). Важнейшей особенностью данных (фазочувствительных) методов является их чрезвычайно высокая чувствительность к изменению коэффициента преломления в исследуемых объектах. Это позволяет определять наличие цитоплазматических выбросов, тяжей, нарушений структуры мембраны и т.д. (рис. 13).

2. Терапевтическое  применение голографии

Перспективы данного применения голографических методов, которое связано с непосредственным воздействием на биологические объекты, гораздо менее очевидны.

Повторим предупреждение, сделанное во вступлении, — в данной статье не рассматривается направление, связанное с гипотетическим голографическим переносом биологической информации. По мнению авторов, в этом направлении в настоящее время очень много мистики и философии, но практически нет науки.

В данной статье будет рассмотрено только одно направление, связанное с голографическими методами формирования световых пучков со структурой, оптимальной для терапевтического применения низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ).

2.1. Перспективы голографии  в НИЛИ-терапии

Авторы считают очень перспективным применение ГОЭ для формирования высокоградиентной пространственной структуры лазерных пучков, оптимальной для использования в НИЛИ-терапии. Тезис о важности пространственной структуры лазерных пучков не является бесспорным и общеизвестным (обычно распределение мощности стараются сделать просто равномерным), поэтому нуждается в пояснении.

В настоящее время существует и успешно применяется множество методик НИЛИ-терапии. Однако, несмотря на достигнутые практические успехи, ряд важнейших вопросов до сих пор остается нерешенным. Как это ни странно, но до сих пор не решен фундаментальный вопрос — о фотофизической (физико-химической) природе НИЛИ-воздействия на биологические объекты.

Существует несколько широкоизвестных гипотез, в которых на роль специфического фактора лазерного излучения, оказывающего биологическое действие, предлагаются моно­хроматичность, поляризация, высокая спектральная плотность мощности, резонансная пульсация лазерного излучения и даже его высокая информационная емкость. Ни одна из данных гипотез не является общепринятой, они не способны объяснить весь круг наблюдаемых явлений и, что наиболее важно, не могут предложить четких критериев выбора оптимальных для терапии параметров лазерного излучения.

В НИИ физики ОНУ совместно с ГУ «Украинский научно-исследовательский противочумный институт им. И.И. Мечникова» сформулирована новая гипотеза [14], согласно которой биологическое действие НИЛИ обусловлено высокоградиентной (высококонт­- растной) структурой лазерного излучения, т.е. такой, в которой пространственные перепады мощности излучения очень часты, велики и резки. Исходно лазерный пучок такой структуры не имеет (волновой фронт гладкий), но при прохождении сквозь рассеивающие его биологические ткани в нем неизбежно формируется спекл-структура (см. пункт 1.2). В спекл-полях градиент плотности мощности как минимум на три порядка больший, чем для некогерентного излучения, что вызывает возникновение локальных электрических полей (эффект Дембера), влияние которых обусловливает биологическое действие НИЛИ.

Таким образом, в данной гипотезе биологическое действие НИЛИ рассматривается как локальный, на клеточном уровне, электрофорез, стимулирующий проникновение биологически активных веществ сквозь мембраны клеток и клеточных органелл. Данная гипотеза не исключает другие, а объединяет их, снимая ряд ранее необъяснимых противоречий.

Важнейшие выводы данной гипотезы:

1. Однородное НИЛИ не должно оказывать специфического биологического действия.

2. Наибольшее биологическое действие НИЛИ оказывает тогда, когда расстояние в нем между темными и светлыми участками сравнимо с размером клеток.

3. Биологически активная структура НИЛИ формируется только после прохождения ~2 мм непрозрачных (рассеивающих) биологических тканей.

Данные выводы получили экспериментальное подтверждение при исследованиях НИЛИ-воздействия на культуры микроорганизмов in vitro. На рис. 14 показаны результаты воздействия НИЛИ, имеющего интерференционную структуру с различным пространственным периодом, на культуру Staphylococcus aureus, находящуюся в чашке Петри в виде монослоя и обработанную слабым раствором гентомицина [14].

Видно, что пик воздействия достигался при пространственных частотах ~1000 линий на миллиметр, что соответствует размерам данных микроорганизмов. В этом случае в результате НИЛИ-облучения количество колоний на облученной половине чашки Петри уменьшалось по сравнению с необлученной в 6 и более раз. Полученный эффект НИЛИ-воздействия при оптимальной структуре светового поля значительно превышает наблюдавшиеся ранее [15–18].

Аналогичные данные были получены при испытаниях разработанной нами лазерной приставки к аппарату электромагнитной терапии «Алмаз».

Из приведенной выше гипотезы и экспериментальных данных неизбежно следует вывод: для вовлечения в терапевтический процесс поверхностных слоев тканей высокоградиентную структуру лазерного излучения (спекловую, интерференционную или даже сингулярную) необходимо сформировать искусственно при помощи насадок на излучатели.

Данный вывод особенно важен в офтальмологии, поскольку в прозрачных тканях глаза спекл-структура не формируется. Конечно, некоторая пространственно-периодическая структура света при облучении глаза все-таки формируется в результате интерференции волн, переотраженных от внутренних деталей глаза, но она неконтролируема, конт­раст в ней мал в силу большой разницы в интенсивностях интерферирующих волн, а соответственно, эффект НИЛИ-воздействия не оптимален.

На рис. 15 представлены возможные конструкции насадок на излучатели, которые могут сформировать требуемую высокоградиентную структуру света.

Естественно, самым простым из них является вариант С, который может представлять собой просто матированное стекло с необходимым размером неоднородностей. На этом фоне варианты А и В кажутся ненужными усложнениями. Однако, возможно, именно они окажутся оптимальными, поскольку только они способны генерировать так называемые сингулярные пучки с заданной структурой. Важность этого свойства рассмотрена ниже.

Как уже было сказано, пространственная структура лазерного излучения внутри биологических тканей слабо зависит от структуры падающего луча, а в основном определяется структурой самих тканей. Определить микроскопические оптические характеристики такой навязанной структуры непосредственно в тканях достаточно сложно, и мнения различных авторов по этому вопросу расходятся [15, 18], кроме того, в разных тканях она может существенно различаться. Неочевидно, что эта структура оптимальна для НИЛИ-воздействия. Если бы удалось искусственно сформировать структуру не только оптимальную, но и устойчивую, сохраняющуюся в тканях на значительном протяжении, то это существенно усилило бы эффект НИЛИ-воздействия. Интересные возможности в этом направлении открываются при использовании сингулярных пучков, которые уже применяются в биологии в качестве оптических пинцетов, поскольку они не только позволяют захватывать и перемещать микрочастицы, но и вращать их.

Голографические генераторы сингулярных пучков для НИЛИ

Сингулярная оптика, или оптика вихревых пучков, — новое и весьма активно развивающееся направление, в частности, в НИИ физики ОНУ [19, 20]. Простейшим видом фазовой сингулярности является винтовая дислокация. При обходе такой сингулярной точки фаза пучка плавно меняется на величину, кратную n·2p, n = ± 1, 2…

Для характеристики таких пучков было введено понятие топологического заряда n, которому приписывается знак зависимости от направления закручивания. Непосредственно в сингулярной точке фаза не определена, поэтому амплитуда светового поля в ней строго равна 0 (рис. 16).

Таким образом, сингулярный пучок с топологическим зарядом 1 представляет собой световую трубку. Важнейшее свойство таких пучков — их уникальная устойчивость (что совершенно невозможно с точки зрения классической оптики). Такие пучки при распространении в однородной среде сохраняют свою структуру сколь угодно долго. Даже если у пучка вырезать его часть, он достроит себя до полноценного вихря. В сингулярных пучках выполняется закон сохранения топологического заряда — сумма всех вихрей в пучке (с учетом их знака) должна оставаться неизменной. Мы полагаем, что это свойство сингулярных пучков позволит создать устойчивую при распространении в тканях высокоградиентную структуру.

Для генерации сингулярных пучков используют синтезированные голо­граммы, которые имеют в своей структуре характерную вилочку (рис. 17). Исходный пучок не имеет особенностей, в первом порядке дифракции пучки имеют топологический заряд ± 1, во втором ± 2 и т.д.

В НИИ физики ОНУ предложено синтезировать ГОЭ с мультивихревой структурой (рис. 17). В мультивихревом пучке, сформированном с его помощью, все вихри будут иметь один знак, следовательно, они не будут аннигилировать, а структура мультивихревого пучка должна иметь очень большую устойчивость даже при распространении в мутных средах. Данные положения нуждаются в экспериментальной проверке, но, возможно, именно такие мультивихревые ГОЭ окажутся наиболее эффективными генераторами пучков для НИЛИ-терапии.

Единственный недостаток синтезированных голограмм — это то, что они являются тонкими и амплитудными, поэтому дифракционная эффективность их крайне невелика (около 3 %). Однако в НИИ физики ОНУ разработана методика их перезаписи на объемные голографические регистрирующие среды. Получаемые таким образом голо­граммы устойчивые, преимущественно фазовые, их эффективность достигает 80 %, т.е. они вполне пригодны для практического применения [21, 22].

Заключение

В данной статье рассмотрены основные результаты применения методов классической и цифровой голографии и близкого к ним метода ESPI для решения медицинских задач. Часть результатов была получена авторами, а разработанные методы запатентованы. В некоторых приложениях голографические методы являются базовыми, в других они выполняют только техническую роль, но в любом случае они несомненно полезны. Это позволяет прогнозировать дальнейшее активное развитие как самих методов, так и их медицинских приложений, в частности в области офтальмологии.

Некоторые из сделанных в статье утверждений не являются бесспорными. Авторы надеются, что аргументы, приведенные в их поддержку, заинтересуют специалистов — как медиков, так и физиков — и смогут стать основой для полезной дискуссии.