Газета «Новости медицины и фармации» Гастроэнтерология (367) 2011 (тематический номер)

В последнее время во всем мире отмечается рост воспалительных заболеваний кишечника, особенно неспецифического язвенного колита (НЯК). Сложность и многоступенчатость изменений, гетерогенность возникающих иммунных и метаболических сдвигов диктуют необходимость дальнейшего изучения патогенеза НЯК [1, 5, 8]. Особую роль в патогенезе играет нарушение барьерной функции слизистой оболочки толстого кишечника. Эффективность базисной терапии НЯК оценивается по уменьшению или устранению развившихся как системных, так и местных воспалительных, цитокиновых, иммунных и морфологических нарушений слизистой оболочки толстой кишки [9]. Исчезновение этих изменений свидетельствует о ликвидации острого воспаления в кишечнике, индукции ремиссии НЯК. Прогнозирование стабильности ремиссии в большей степени может быть связано с нормализацией слизистого барьера толстой кишки. Состояние слизистого барьера толстого кишечника определяется функциональными изменениями слизистой оболочки толстой кишки, свойствами толстокишечной слизи и количественным и качественным составом кишечной микрофлоры [2, 4, 6]. Влияние базисной терапии НЯК на слизистый толстокишечный барьер позволит не только оценить эффективность ликвидации обострения, но и прогнозировать дальнейшее течение заболевания.

Целью данной работы была оценка изменений слизистого барьера толстого кишечника и их роли в патогенезе НЯК.

Было обследовано 30 больных с левосторонним НЯК в стадии обострения, среди которых было 16 мужчин и 14 женщин. Средний возраст больных составлял 36,2 ± 4,2 года. Помимо общеклинических методов обследования всем больным НЯК было проведено повторное эндоскопическое исследование с биопсией слизистой оболочки толстой кишки и морфологическое исследование биоптата. Фиксация биоптата слизистой толстой кишки проводилась в 4% растворе нейтрального формалина на одни сутки с последующей заливкой в парафин. Гистологические срезы толщиной 4–5 микрон производили на микротоме для парафиновых срезов. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, что позволило получить общие представления и оценить состояние исследуемой ткани. По этому препарату оценивали выраженность воспаления в слизистой толстой кишке, интенсивность и клеточный состав инфильтрата, количество и зрелость бокаловидных клеток [7]. Для характеристики слизеобразования проводилась PAS-реакция, с помощью которой выявляли гликопротеиды, гликолипиды и гликоген. При исследовании этих препаратов определяли количество PAS-положительных веществ в слизи и число активных лейкоцитов, содержащих гликоген в клеточном инфильтрате. Другие срезы окрашивали альциановым синим при значениях рН 1,0 и 2,5. При рН 1,0 сульфатные группы углеводов приобретают достаточный заряд для связывания положительно заряженных молекул красителя. При рН 2,5 окрашивали как сульфатные, так и карбоксильные группы углеводов, которые входят в состав сиаловых, глюкуроновой и индуроновой кислот. С помощью этой методики определяли сульфатированные и несульфатированные гликозамингликаны, протеогликаны, гликопротеины и гликоген [4, 7]. Проводилась также лектинная гистохимия с использованием меченных пероксидазой лектинов. Применялись лектины завязей пшеницы, WGA-тропные к N-ацетил­глюкозамину, N-ацетилнейраминовой кислоте (сиаловой кислоте) (NANA), арахиса, PNA-тропные к b-D-галактозе (b-D-Gall), бобовника анагиралистного, LAL-тропные к a-L-фукозе (a–L-Fuc), омелы белой, ML-1-тропные к a-L-галактозе (a-DGal), сои, SBA-тропные к a-N-ацетилгалактозамину (a-DGalNAc), D-галактозе, семян чечевицы, LCA-тропные к a-D-маннозе (a-DMan), D-глюкозе, N-ацетилглюкозамину, виноградной улитки, HPA-тропные к a-N-ацетилглюкозамину (a-GlcNAc), бузины черной, SNA-тропные к D-галактозамину (a-GalNAc). Летинная гистохимия по чувствительности и селективности в выявлении определенных молекулярных структур значительно превосходит традиционные методы гистохимии углеводов, что позволяет использовать этот метод в определении отдельных олиго- и дисахаридов при расшифровке состава муцинов. Кроме того, по ней можно оценивать количество специфических рецепторов не только в эпителиальных клетках, но и в строме. Состояние рецепторного аппарата колоноцитов во многом предопределяет возможности колонизации микрофлоры толстой кишки, ее жизнедеятельность и состав [3, 4, 7].

В динамике изучали состояние микрофлоры толстой кишки, определяли количественный и качественный состав облигатной и факультативной флоры. Забор кала проводился утром в стерильную посуду и в течение 45 минут доставлялся в микробиологическую лабораторию. Определяли количество бифидобактерий, лактобацилл, кишечной палочки с исследованием ее ферментативных свойств, изучали количественный и качественный состав факультативной флоры с исследованием количества стафилококков и их ферментативных свойств, стрепто- и энтерококков, клостридий, клебсиелл, протея, энтеробактера, цитобактера, грибов рода Candida.

Все обследованные больные в качестве базисной терапии получали салофальк® в дозе 3,0 г в сутки в течение 30 дней. Эндоскопические, морфологические и микробиологические исследования проводились у больных НЯК до начала терапии и после ее окончания.

Результаты

Клиника НЯК была типичной и характеризовалась нарушениями стула, поносами до 20 раз в день с примесью крови и слизи, тенезмами, ночными дефекациями, вздутиями кишечника, болевым, астеноневротическим синдромами. Среди обследованных больных НЯК у 18 (60,0 %) пациентов выявлено среднетяжелое течение НЯК, а у 12 (40,0 %) диагностировано легкое течение НЯК. Для оценки динамики состояния больного и определения эффективности проводимой терапии у пациентов определяли активность заболевания по индексу клинической активности. Индекс высчитывали в баллах [10]. Индекс клинической активности у обследованных больных НЯК составил 10,54 ± 0,91 балла. При эндоскопическом исследовании у всех больных НЯК до терапии выявляли гиперемию слизистой оболочки толстой кишки с изменением сосудистого рисунка, отечность слизистой толстой кишки с «зернистостью» — грануляциями мембранной поверхности слизистой оболочки, рассеивающими отраженный свет. Эрозии или язвы, повышенная ранимость слизистой оболочки толстой кишки, примеси слизи, фибрина, гноя обнаружены практически у всех больных, и степень выраженности этих изменений коррелировала со степенью тяжести НЯК.

Для объективизации динамической оценки эндоскопических изменений слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК было проведено определение эндоскопического индекса, который включал наличие грануляций мембранной поверхности слизистой оболочки, рассеивающих отраженный свет, изменений сосудистого рисунка, ранимость и контактную кровоточивость, поражения слизистой оболочки (эрозии, язвы, фибрин, слизь) и высчитывался в баллах [11]. Эндоскопический индекс в целом по группе больных НЯК составил 7,2 ± 0,7 балла.

До терапии у всех больных НЯК выявлено снижение числа бокаловидных клеток, но степень их уменьшения коррелировала с тяжестью НЯК и варьировала от незначительного уменьшения количества бокаловидных клеток с преобладанием клеток с мелкими, незрелыми вакуолями у больных НЯК при легкой степени до выраженного снижения и иногда полного отсутствия бокаловидных клеток у пациентов со среднетяжелым течением НЯК. Выявлено истончение, дистрофия поверхностного эпителия с перестройкой крипт, кроме того, у всех больных обнаруживались дефекты поверхностного эпителия — от микроэрозий до глубоких язв, заполненных некротическими массами. На этом фоне у всех больных НЯК выявлена усиленная воспалительная клеточная инфильтрация слизистой оболочки толстой кишки, интенсивность которой колебалась от умеренной до выраженной.

В воспалительном клеточном инфильтрате у больных НЯК чаще преобладали лимфоциты — 24 (80,0 %) больных, плазмоциты — у 18 (60,0 %) пациентов, а макрофаги — у 14 (46,7 %). Нейтрофилы обнаруживались в инфильтрате у 18 (60,0 %) больных НЯК, при этом активные сегментоядерные лейкоциты, содержащие гликоген, обнаружены у 13 (43,3 %) пациентов. Более чем у половины больных НЯК выявлялись внутриэпителиальные лимфоциты, что может являться маркером активности процесса.

Помимо изменений клеточного состава слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК выявлены нарушения слизеобразования. У всех больных отмечено уменьшение количества внутриклеточной и внеклеточной слизи с изменением ее свойств. При проведении PAS-реакции, окрашивания альциановым синим рН 2,5 и рН 1,0, лектинами интенсивность окрашивания у всех больных НЯК была ниже нормы (P < 0,01), что свидетельствует об изменениях состава толстокишечной слизи, уменьшении в ней гликозамин­гликанов и гликопротеинов. Количество N-ацетилнейраминовой кислоты, сиаловых кислот (окраска WGA) у больных левосторонним НЯК было снижено. При снижении общего количества галактозы (окраска PNA и ML-1) выявлялись модификации ее изомеров. Если количество ­a-D-галактозы по мере роста степени тяжести НЯК достоверно снижалось (окраска PNA), то уровень a-D-галактозы (окраска ML-1) у больных с различной степенью тяжести НЯК достоверно не отличался. Количество галактозамина и фукозы (окраска SBA, SNA и LAL) было достоверно снижено у всех больных НЯК. Уровень маннозы (окраска LCA) был минимальным у пациентов с левосторонним НЯК средней тяжести, а у больных с легким течением НЯК снижался незначительно. В то же время уровни глюкозы и глюкозамина (окраска HPA) существенно не изменялись у больных с различной степенью тяжести НЯК.

На фоне изменения количества толстокишечной слизи, ее свойств отмечено нарушение микробного пейзажа толстой кишки у больных НЯК до терапии. Патогенные микроорганизмы не были выделены ни у одного больного, а облигатная флора — бифидобактерии, лактобациллы и кишечная палочка — высевались почти у всех больных (96,7; 96,7; 100,0 % соответственно). В целом по группе больных НЯК бифидобактерии и лактобациллы высевались реже, чем у здоровых, при этом их количество и удельный вес были достоверно снижены. У больных НЯК при снижении количества кишечной палочки отмечалось повышение ее удельного веса (20,5 ± 2,0 % у больных НЯК и 16,6 ± 1,8% у здоровых (P < 0,05)), а также модификация ее ферментативных ствойств с увеличением количества штаммов со сниженной ферментативной активностью и гемолизирующих форм E.coli. Энтерококки, которые высевались у всех здоровых людей, у больных НЯК выделены лишь у 13 (43,3 %) пациентов (P < 0,01). Чаще всего высевались энтерококки видов E.faecalis, E.aerogenes. Количество и удельный вес энтерококков в общей бактериальной популяции достоверно не изменялись. Снижение количества облигатной флоры приводило к понижению колонизационной резистентности и росту факультативных бактерий. Энтеробактер у больных НЯК высевался достоверно чаще, чем у здоровых (40,08 и 24,0 % соответственно, P < 0,01), при этом его количество и удельный вес также достоверно превышали показатели здоровых лиц. Наиболее часто высевались E.agglomerans, E.gergoviae, E.sakazaki. Частота встречаемости стафилококков у больных НЯК была несколько выше, чем у здоровых, однако их количество и удельный вес у пациентов с НЯК достоверно не отличались. У больных НЯК, как и у здоровых лиц, чаще высевались S.epidermidis, S.aureus. Клебсиеллы высевались достоверно чаще у больных НЯК — 14 (46,7 %) пациентов, при этом их количество возрастало почти в 3,5 раза, а удельный вес — в 9,8 раза. Чаще всего у больных НЯК встречались K.oxyboca, K.pneumoniae. Клостридии у больных НЯК также высевались достоверно чаще. Они выделены у 12 (40,0 %) больных, при этом их количество не отличалось от нормы, но удельный вес был почти в 3 раза выше, чем у здоровых. Частота высеваемости протея у больных НЯК была выше, чем у здоровых лиц, в 2,3 раза. Протей был выделен у 11 (36,7 %) пациентов с НЯК. Его количество было выше, чем у здоровых лиц, в 5,25 раза и составляло 2,52 ± 0,22 lg КОЕ/г при норме 0,48 ± 0,19 lg КОЕ/г (P < 0,001), при этом его удельный вес превышал норму в 14,5 раза (P < 0,001). Чаще у больных НЯК высевался протей рода P.mirabilis. Количество цитобактера у больных НЯК достоверно превышало нормальные показатели (2,28 ± 0,22 и 1,79 ± 0,32 lg КОЕ/г соответственно (P < 0,05)), а удельный вес был в 22 раза выше, чем у здоровых лиц (P < 0,0001). Грибы рода кандида у больных НЯК высевались с той же частотой, что и у здоровых лиц, а их количество и удельный вес соответствовали нормальным показателям.

Таким образом, у больных НЯК развивается дисбактериоз, который характеризуется снижением частоты встречаемости, количества и удельного веса облигатной флоры и увеличением факультативных бактерий. Дисбактериоз на фоне нарушения метаболизма клеток кишечного эпителия, изменения синтеза слизи и ее химизма способствует повышению проницаемости слизистого барьера толстой кишки, что приводит к усилению воспаления, развитию более распространенного процесса в толстом кишечнике и может способствовать формированию внекишечных проявлений.

На фоне терапии состояние больных достоверно улучшалось. На фоне 30-дневного лечения положительная клиническая динамика с улучшением самочувствия и уменьшением клинической симптоматики отмечена у всех больных НЯК. В то же время клиническая ремиссия НЯК выявлена у 27 (90,0 %) больных, а эндоскопическая — у 25 (83,3 %) пациентов. На 16,9 ± 2,1 день у больных НЯК отмечено исчезновение болевого синдрома, тенезмов, ночного стула. В то же время нормализация частоты стула, исчезновение примеси крови и слизи в кале, вздутия и урчания кишечника отмечались только у больных на фоне достижения полной клинической ремиссии. В целом по группе больных НЯК после терапии индекс клинической активности составил 2,89 ± 0,31 балла, а эндоскопический индекс был 2,3 ± 0,3 балла, что может свидетельствовать о достаточно высокой эффективности проводимой терапии.

 На фоне положительной клинической динамики у больных НЯК отмечена тенденция к нормализации микробного пейзажа толстой кишки (табл. 1). На фоне терапии повышалось общее количество кишечной палочки, при этом уменьшалось количество кишечной палочки со сниженными ферментативными свойствами и гемолизирующих штаммов Е.coli. Число бифидобактерий и лактобацилл на фоне терапии достоверно не менялось. В то же время после лечения у больных НЯК отмечена тенденция к уменьшению количества факультативной флоры. При использовании салофалька® выявлено достоверное снижение количества энтеробактера, протея и цитобактера (P < 0,05).

Следовательно, на фоне применения базисной терапии НЯК с включением салофалька® отмечается тенденция к нормализации микробного пейзажа толстой кишки с увеличением количества кишечной палочки, с нормализацией ее ферментативных свойств, уменьшением количества энтеробактера, протея, цитобактера. Возможно, это связано с улучшением метаболизма слизистой оболочки толстого кишечника и тенденцией к нормализации слизеобразования в толстой кишке.

После лечения у всех больных выявлена положительная гистологическая динамика, которая выражалась в снижении интенсивности клеточной инфильтрации слизистой оболочки толстой кишки. Гистологическая ремиссия выявлена у 24 (80,0 %) больных НЯК. Следует отметить, что у 6 (20,0 %) больных, у которых выявлялись сегментоядерные лейкоциты в клеточном инфильтрате до лечения, эти клетки обнаруживались и после терапии. В то же время после лечения сегментоядерные лейкоциты, обнаруживаемые в слизистой оболочке толстой кишки, не содержали гликоген, что свидетельствует об отсутствии местной воспалительной активности. После лечения число бокаловидных клеток увеличивалось, они содержали более зрелую слизь. У 10 (30,0 %) больных НЯК выявлялось нормальное количество бокаловидных клеток, содержащих зрелую слизь. Почти у всех больных отмечено повышение интенсивности окрашивания при проведении PAS-реакции и методики с альциановым синим, особенно при pH 2,5. Это свидетельствует о нормализации процессов слизеобразования и нормальном соотношении сульфатированных и несульфатированных гликозамингликанов в кишечной слизи.

 Количество отдельных моносахаридов слизи у больных после терапии повышалось (табл. 2). Количество галактозы (окраска PNA и ML-1), уровень глюкозы и глюкозамина (окраска HPA) достоверно возрастали, но уровень галактозамина, фукозы, маннозы слизи (окраска SNA, LAL, LCA) увеличивался недостоверно. Полной нормализации слизеобразования у больных НЯК не наблюдалось, поэтому больным рекомендовали продолжить прием салофалька® для поддержания ремиссии. Улучшение слизеобразования на фоне применения салофалька® у больных НЯК способствовало более стабильной и длительной ремиссии. Если у больных, не принимавших поддерживающую дозу препарата, ремиссия длилась 9,2 ± 1,1 месяца, то у пациентов, получавших cалофальк® в ремиссии, продолжительность ее составляла 14,1 ± 1,4 месяца (P < 0,05).

Таким образом, изменения слизистого барьера являются патогенетически значимыми у больных НЯК. Применение салофалька® является эффективным у больных НЯК. Его использование не только оказывает выраженный противовоспалительный эффект, но и приводит к нормализации процессов слизеобразования, стимулирует продукцию слизи, способствует ее созреванию, что, возможно, обусловливает нормализацию количества и ферментативных свойств кишечной палочки и тенденцию к уменьшению количества факультативной флоры. Это способствует более стабильной и длительной ремиссии НЯК у таких больных.