Газета «Новости медицины и фармации» Акушерство, гинекология, репродуктология (381) 2011 (тематический номер)

В настоящее время разработан экспресс-анализ, основанный на количественной флюоресцентной полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с последующим капиллярным электрофорезом для анализа меченого флюоресцентного продукта — QF-PCR. Этот анализ не требует высоких затрат и выполняется в течение одного рабочего дня. Данная технология предполагает количественное определение микросателлитных аллелей, амплифицированных с использованием меченых праймеров, с последующим разделением по размеру и измерением количества каждой аллели по размеру пика на полуавтоматическом генетическом анализаторе [3].

На основании данной методики были разработаны и применены в пренатальной диагностике стандартные наборы для скрининга [7]. Количество и разнообразие микросателлитных маркеров в этих тестах позволяет надежно отделить нормальный набор хромосом от трисомии, а также исключить мозаицизм и загрязнение пробы материнским генетическим материалом. Как и в большинстве ПЦР-анализов, такой подход позволяет быстро получить результаты, используя минимальные затраты.

С учетом всех имеющихся лабораторных возможностей для пренатальной диагностики нами было предложено применение микросателлитных маркеров изучаемых хромосом для последующего их анализа по размеру и количеству с помощью микрокапиллярного электрофореза на ДНК-микрочипах фирмы BIO-RAD вместо стандартного электрофореза на секвенаторе. Это делает возможным проведения анализа ДНК плода за 4–5 часов, не повышая при этом его себестоимости.

Целью данной работы была модификация метода QF-PCR для использования в экспресс-анализе синдромов Патау, Эдвардса, Дауна и Тернера.

Материалы и методы

Подготовка проб и методика диа­гностики анеуплоидий. Кровь 30 больных с синдромом Дауна и 30 пациентов с нормальным кариотипом отбиралась в пробирки с этилендиаминтетраацетатом объемом 5 мл. Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографина. После разделения на градиенте лимфоциты дважды отмывали забуференным физраствором и окрашивали гематоксилин-эозином. Затем лимфоциты разводили титрованием в микропланшетах в среде 199 до состояния, когда концентрация лимфоцитов была 2–10 в 50 мкл, переносили каплю на предметное стекло и отбирали единичные лимфоциты с помощью микроманипулятора, каждый лимфоцит в отдельный стерильный эппендорф (свободные от ДНКаз и РНКаз), содержащий 2 мкл деионизированной воды без ДНКаз. Если анализировали единичные лимфоциты, то предварительно проводили полногеномную амплификацию ДНК с помощью набора Repli-g-Midi kit (Qiagen) согласно методике. После амплификации проверяли концентрацию ДНК в пробе на флюориметре (Nanodrop, USA) с флюоресцентным красителем ДНК SybrGreen. Далее проводили амплификацию специфическими праймерами на микросателиитные маркеры (табл. 1). Реакцию амплификации проводили набором Multiplex PCR kit (Qiagen). Если исходного ДНК было достаточно (концентрация ДНК более 1 нг), сразу выполняли специфическую амплификацию с мечеными праймерами к микросателлитным маркерам.

Продукты амплификации наносили на микрочипы Experion DNA 1К(ВIO-RAD) для анализа ДНК-ампликонов в 1 мкл. Автоматический микроэлектрофорез проводили согласно методике (BIO-RAD) на приборе Experion (BIO-RAD). После электрофореза делали анализ фореграмм с помощью программы обработки данных Experion Software version 2.1.158.0, которая показывает наличие пиков, количество ДНК в каждом пике, высоту пиков, их площадь. Соотношение пиков для диплоидного набора хромосом — 1 : 1–1 : 1,5. Соотношение между пиками больше 1 : 1,5 или наличие трех аллелей для одного маркера говорит о триплодии. Чтобы исключить ошибки, например, при мозаицизме, для каждой хромосомы берется как минимум 2 маркера.

Результаты и обсуждение

Содержание ДНК в пробе после полногеномной амплификации ДНК, выделенной из плодовых эритроцитов, варьировало в пределах 0,03–0,15 мкг/мл. Данное количество геномной ДНК позволяет провести анализ хромосомного набора по изучаемым хромосомам с использованием метода количественной ПЦР с микроэлектрофорезом. Для анализа микросателлитных маркеров мы впервые использовали флуоресцентний микроэлектрофорез на микрочипах, позволяющий использовать микроколичества ДНК в объеме 1 мкл. Как видно на рис. 1, D21S11-маркер показал три пика, что доказывает наличие триплоидии по 21-й хромосоме. Маркер D13S634 показал наличие 2 пиков с соотношением 1 : 1,1, что свидетельствует о диплоидном наборе по 13-й хромосоме (рис. 2). Маркер Dl3S305 при анализе ДНК показал наличие диплоидного набора хромосом. STS-маркер D18S386 также показал наличие диплоидного набора 18-й хромосомы (рис. 3). Определение пола осуществляли по амилогенину и SrY-маркеру (секс-детерминированный регион Y-хромосомы). Загрязнение материала материнской ДНК может быть исключено одновременным анализом материнской ДНК по тем же микросателлитным маркерам. Таким образом, полногеномная амплификация позволяет проводить анализ хромосомных анеуплоидий нескольким клеткам плода.

В нашей работе были использованы маркеры для анализа анеуплоидий 21, 13 и 18-й хромосом.

Выводы

Предложенная модификация метода QF-PCR позволяет идентифицировать хромосомные анеуплоидии плода.

Предложенная модификация метода QF-PCR значительно сокращает продолжительность анализа хромосомных триплоидий до 4 часов без повышения его стоимости.

Метод может быть использован для малоинвазивной пренатальной диагностики по ДНК, выделенной из эритроцитов плода, циркулирующих в крови матери.