Журнал «Медико-социальные проблемы семьи» 1 (том 17) 2012

Всемирная организация здравоохранения назвала бесплодие одной из наиболее важных проблем здоровья современного человечества, так как в современном мире нарушениями репродуктивной функции страдает каждая шестая супружеская пара [1, 3, 7]. Количество бесплодных пар постоянно растет не только из-за позднего репродуктивного возраста женщин, но и в связи с ухудшением качества гамет вследствие неблагоприятных средовых факторов и особенностей современного стиля жизни [2, 3, 10].

Со времени рождения первого ребенка с помощью in vitro fertilization (IVF) в 1978г., во всем мире с помощью ВРТ появилось почти 2 млн. детей [8, 12]. Контингент пациентов программ ВРТ достаточно широкий, и в настоящее время он не ограничивается бесплодными парами. Наряду с ними к ВРТ прибегают одинокие женщины, ВИЧ-дискордантные пары, родители, пытающиеся с помощью предгестационной диагностики в программах ВРТ выбрать HLA-соответствующего эмбриона и решить проблему лечения больного сибса путем использования стволовых клеток пуповинной крови [10].

Широкое распространение методов ВРТ делает актуальными вопросы изучения генетического риска для детей, рожденных с помощью этих методов. В современной литературе имеются данные о повышенном материнском и перинатальном риске при ВРТ-беременности, и если ранее это связывалось только с многоплодием, то в последствии было показано, что и одноплодная ВРТ-беременность ассоциирована с повышенным риском вагинальных кровотечений, предлежания плаценты, преэклампсии, недоношенности, СЗРП, причины которых до конца не выяснены [11]. Что касается увеличения частоты врожденных пороков развития (ВПР) у детей, рожденных с помощью ВРТ, то здесь данные неоднозначные – от отсутствия существенного риска, до его 25-40 % возрастания [8, 12].

Возможных причин, вызывающих повышение риска ВПР и перинатальных осложнений у ВРТ-детей может быть несколько, и, если исключить многоплодие, то они могут быть отнесены к самой процедуре применения ВРТ (микроманипуляции с гаметами), воздействию на гаметы препаратов для стимуляции овуляции, состоянию здоровья бесплодных родителей.

Целью нашей работы явилось изучение генетических особенностей супружеских пар с бесплодием в программах ВРТ.

Материалы и методы 

На первом этапе нами были обследованы 186 супружеских пар с бесплодием, включенные в программы ВРТ в 2007-2010 гг. Все пациенты были разделены на две группы.

Группу 1 составили 122 супружеские пары с женским бесплодием различной этиологии: трубно-перитонеального генеза – у 37 (30,3%); эндокринного – у 49 (40,2%), эндометриоз – у 30 (24,5%); маточный фактор – у 6 (5%). Этим пациентам проводились программы IVF.

Группу 2 составили 64 супружеские пары с мужским фактором бесплодия, этим парам проводились IVF + intracytoplasmic sperm injection (ICSI). В группе 1 возраст женщин был 26-45 лет, мужчин – 32-55 лет; в группе 2 соответственно 24-43 и 30-62 года.

В нашей работе мы применяли медико-генетическое консультирование (МГК) всех супружеских пар с применением генеалогического анализа. Дополнительно к стандартному обследованию для программы IVF были произведены: исследование кариотипа, ядер сперматозоидов методом FISH, генов CFTR, AZF-локуса, FMR1, AR. Цитогенетическое исследование было проведено на препаратах метафазных хромосом, которые получали из лимфоцитов периферической крови, культивируемых в условиях in vitro, в соответствии со стандартной методикой [9], хромосомы идентифицировали после дифференцированного окрашивания (С-метод).

Для молекулярно-цитогенетических исследований препараты клеток эякулята готовили по методу, предложенному в 1994 г. Н. Guttcnbach [9], гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой-производителем. Молекулярно-генетические исследования проводились методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно рекомендациям фирм-производителей.

На втором этапе нами сформирована группа А из 35 супружеских пар (из пациентов групп 1 и 2 на I-м этапе), которые имели 2 и более неэффективные программы ЭКО, для выявления наследственных предпосылок нарушения имплантации. Возраст женщин и мужчин в этой группе составил соответственно 28±0,5 лет и 35±0,2 лет. В эту группу мы отбирали пациентов без очевидных предпосылок неэффективных программ ВРТ – с нормальным кариотипом, отсутствием носительства гена CFTR, микроделеций локуса AZF у мужчин, женщин с достаточным овариальным резервом (по данным ультразвукового исследования, исследования фолликулостимулирующего гормона, ингибина, антимюллерового гормона), без внутриматочной патологии (аномалии развития матки, фибромиома матки, аденомиоз).

Контрольную группу В составили 11 супружеских пар, у которых программа ЭКО была успешной в течение 1-2 циклов. По возрастным характеристикам, анамнестическим данным, состоянию соматического и репродуктивного здоровья эти группы были сопоставимы.

У этих пациентов нами дополнительно проводилось исследование полиморфизма генов системы фолатного обмена (MTHFR, MTRR), генов I фазы системы детоксикации цитохрома P 450 (CYP1A1), генов II фазы системы детоксикации глутатионтрансферазы (GSTP, GSTM1, GSTT1).

Статистическую обработку результатов проводили по t-критерию в компьютерной программе STATISTICA, а также по χ² в компьютерной программе STATGRAF. Достоверными считали различия при значениях с вероятностью р≤0,5.

Результаты и их обсуждение

Изучение семейного анамнеза супружеских пар, находящихся под наблюдением, позволило обнаружить у 55 (45,1%) пациентов (женщин и мужчин) нарушения в репродуктивном анамнезе у родственников I и II степени родства.

В 1 группе 30 (24,6%) пар имели подобные проблемы: у 10 (8,2%) женщин и у 7 (5,7%) мужчин у родственников отмечено бесплодие, у 7 (5,7%) и 5 (4,1%) – невынашивание беременности, у 1 пациентки у двоюродной сестры – синдром Шерешевского-Тернера (45 Х0).

В группе 2 у 19 (29,7%) супружеских пар у родственников I и II степени родства выявлен осложненный репродуктивный анамнез: бесплодие в семьях у 2 (3,1%) женщин и у 7 (10,9 %) мужчин, невынашивание беременности соответственно у 3 (4,7%) и 5 (7,8%), у 1 пациента родной брат имел полисомию по хромосоме Y (47XYY), у 1 – двоюродный брат страдал муковисцидозом.

При МГК и обследовании на носительство мутаций некоторых генов, в том числе «динамических» мутаций в группе 1 у 2 женщин выявлен синдром Рокитанского-Кюстнера-Хайшера, у 2 – врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН), обусловленная недостаточностью 21-гидроксилазы (мягкая форма), у 2 – ≥ 40 СGG-повторов в гене FMR1. В группе 2 у 1 пациентки была мягкая форма ВДКН, обусловленная недостаточностью 21-гидроксилазы.

Во 2-й группе у 2 мужчин выявлен синдром Юнга, у 1 – неполный синдром Картагенера, у 1 – поликистоз почек у 2 – микроделеции AZF-локуса Y-хромосомы, у 2 – мутации гена муковисицидоза СFTR, у 2 – ≥ 30 САG-повторов в гене AR.

Генетические нарушения в 2 раза чаще встречались в группе 2. Отягощенность генетического статуса у бесплодных супругов указывает на важность МГК до начала программ ВРТ. При выявлении генетической патологии пациенты должны быть осведомлены о риске передачи потомству этих нарушений, так как решение о лечении методами ВРТ принимает супружеская пара.

Так, например, наличие динамических мутаций в гене AR-рецептора при количестве САG-тринуклеотидных повторов более 30 вызывает нечувствительность тканей к андрогенам с развитием азооспермии, а экспансия САG-тринуклеотидных повторов более 50 в последующих поколениях может приводить к рождению мальчиков со спинобульбарной мышечной атрофией. Возрастание количества СGG-повторов в гене FMR1 более 44 сопряжено с преждевременным истощением яичников, а их экспансия до 200 приводит к развитию синдрома Мартина-Бела, наиболее распространенной после синдрома Дауна формы умственной отсталости [5].

Уровень хромосомных изменений у пациентов 2-й группы был выше (12,5% по сравнению с 9,8% в 1 группе,р<0,05) за счет хромосомной патологии у мужчин с азооспермией. Наши данные о высоком уровне хромосомных аберраций у пациентов с бесплодием по сравнению с общепопуляционными подтверждаются результатами исследований других авторов [3].

При анализе данных кариотипа, в группе 1 у женщин обнаружено преобладание хромосомных изменений в комплексе половых хромосом в виде мозаицизма (46ХХ/45Х0 – у 3 (2,5%), 46ХХ/47ХХХ – у 3 (2,5%), 46ХХ/47ХХХ/45Х0 – у 2 (1,6%)). Хромосомные перестройки аутосом были представлены в 1 наблюдении перицентрической инверсией (46ХХ, inv(2)(p12q14)).

У мужчин группы 1 в 1 случае выявлена перицентрическая инверсия (46XY, inv(2)(p12q14)).

Исследование кариотипа у супружеских пар в группе 2 позволило выявить нормальный кариотип у 87,5%, хромосомную патологию – у 12,5% (во всех случаях у мужчин).

Результаты исследования показали, что среди хромосомных изменений у мужчин группы 2 обнаруживались перестройки аутосом, представленные транслокациями и перицентрическими инверсиями (у 1 – 46XY, inv(3)(p21q12); у 1- 46XY, t(13/14)(q10q10); у 1 – 46XY, t(7/16)(q21q22); у 1 – 46XY, inv(7)(p11q11)), также выявлены кариотипы, соответствующие синдрому полисомии хромосомы Y (у 1 – полная форма 47 XYY и у 1 – мозаичная 47XXY/46XY), мозаичной форме синдрома Клайнфельтера (у 1 – 47XXY/46XY), мозаицизм с присутствием клона клеток с женским кариотипом (у 1 – 46XY/46 ХХ).

FISH исследование сперматозоидов произведено 85 пациентам групп 1 и 2. Всего из группы 1 было обследовано 27 мужчин. Средняя частота анеуплоидий в сперматозоидах по хромосомам Х и Y у мужчин с нормальным кариотипом составила 0,25%, что сравнимо со значением в популяции фертильных мужчин, с нормальными показателями спермограммы (<0,6%) [3, 8]. У пациента с инверсией хромосомы в кариотипе – 0,9% анеуплоидий по хромосомам Х и Y.

Из группы 2 было обследовано 58 мужчин. Средняя частота анеуплоидий в сперматозоидах по хромосомам Х и Y у мужчин с нормальным кариотипом составила 0,49%. У пациента с мозаичной формой полисомии хромосомы Y в кариотипе доля анеуплодии по хромосомам Х и Y в сперматозоидах была 0,8%, при инверсиях 3-й и 7-й хромосом в кариотипе – 1,2%; при робертсоновской транслокации 13/14 – 1,6%, при транслокации 7/16 – 1,4%.

У пациентов с нормальным кариотипом в обеих группах соотношение сперматозоидов с хромосомой Х к сперматозоидам с хромосомой Y было 1:1. Выявленная в сперматозоидах хромосомная патология была представлена нерасхождением хромосом ХY, ХХ, YY.

Таким образом, хромосомные аберрации могут явиться одной из причин, приводящей к бесплодию, и, как следствие, у этих пациентов могут формироваться гаметы с хромосомными аберрациями. Исследования сперматозоидов пациентов с аномалиями в кариотипе методом FISH позволили выявить высокую частоту анеуплодий гоносом, что подтверждает существование интерхромосомного эффекта, когда независимо от того, какие хромосомы вовлечены в хромосомные аберрации, в кариотипе в процессе мейоза могут происходить нарушения расхождения любых других хромосом [2, 3]. Таким образом, у пациентов с изменениями в кариотипе могут формироваться гаметы с мутациями de novo, использование которых в программах ВРТ может привести к рождению ребенка с генетической патологией.

На втором этапе проведено исследование полиморфизма генов I фазы системы детоксикации, которое не выявило достоверных различий в частоте аллельных вариантов в группах пациентов с эффективными и неэффективными программами ЭКО (группы А и В) (Р>0,05).

Исследование полиморфизма генов II фазы системы детоксикации выявило в группе А повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа по гену GSTM1 у 51, 4% женщин, по гену GSTT1 у 28,6%, по гену GSTP1 у 17,1% по сравнению с группой контроля соответственно 36,4%, 18,2 %, 9,1% (Р<0,05). У 10 (28,6%) женщин выявлено увеличение частоты сочетанных «неблагоприятных» генотипов по 2 генам системы детоксикации GSTM1 и GSTT1 или GSTM1 и GSTP1, у 4 (11,4 %) – по трем генам GSTM1, GSTT1,GSTP1. Таких сочетанных «неблагоприятных» генотипов в группе контроля не было (Р<0,05).

У мужчин группы А также достоверно чаще определялись сочетанные «функционально неблагоприятные» генотипы по трем генам GSTM1, GSTT1, GSTP1, Р<0,05).

Таким образом, проведенное обследование пар с неэффективными программами ЭКО показало повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа по генам GSTM1, GSTT1, GSTP1 (генов II фазы системы детоксикации) как у женщин, так и мужчин. Как известно, гены этой системы участвуют во второй фазе детоксикации и катализируют процессы метаболизма различных ксенобиотиков и канцерогенов, поступающих в организм; они играют важную роль в антенатальном развитии и активно влияют на устойчивость зародыша к неблагоприятным экзогенным факторам [6].

При анализе полиморфизма генов фолатного цикла MTHFR и MTRR также выявлены статистически значимые результаты. У женщин группы А отмечено значительное увеличение частоты «функционально ослабленного» генотипа MTHFR Т/Т по сравнению с пациентками группы контроля (34,3% и 18,2%, Р<0,05). При этом у мужчин группы А также достоверно увеличена частота генотипа MTHFR Т/Т (45,7%) по сравнению с мужчинами контрольной группы (18,2%, Р<0,05).

При изучении полиморфизма второго гена фолатного цикла MTRR зарегистрировано повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа MTRR G/G у женщин и мужчин группы А по сравнению с группой контроля (Р<0,05). Кроме того, у 5 (14,3%) женщин группы А отмечено сочетание «функционально неблагоприятных» генотипов: MTHFR Т/Т и MTRR G/G; у 3 (8,6%) мужчин из пар группы А – MTHFR Т/- и MTRR G/G.

Таким образом, у пар с неэффективными программами ЭКО в нашем исследовании достоверно чаще встречались низкофункциональные аллели генов фолатного обмена. В литературе есть данные, что наличие низкофункциональных аллелей генов фолатного обмена вследствие изменения профиля метилирования ДНК в клетке может приводить к нарушению расхождения хромосом в процессе формирования гамет и возникновению анеуплоидии у плода. Данные механизмы описаны для трисомий 21, 18 [6]. Дефицит метильных групп в быстро делящихся клетках эмбриона приводит к повышенному включению уридилового нуклеотида вместо тимидилового в синтезируемую цепь ДНК. В результате образуется аномально легко фрагментируемая ДНК, синтез ее резко замедляется, что ведет к нарушению клеточного цикла быстро делящихся клеток плода, и, возможно, способствует запусканию механизмов апоптоза [4].

При нарушении фолатного обмена, кроме вышеперечисленных механизмов нарушения эмбриогенеза, происходят нарушения некоторых звеньев имплантации. У людей с «функционально ослабленными» генотипами по генам MTHFR и MTRR формируется гипергомоцистинемия, что приводит к эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся развитием атеросклероза сосудов, десинхронизацией процессов фибринолиза и фибринообразования, вазоконстрикцией, что, вероятно, способствует нарушению нидации плодного яйца, инвазии трофобласта [4, 6].

Выводы

Супружеским парам, участвующим в программах ВРТ необходимо проводить МГК и генетическое обследование для выявления хромосомной и моногенной патологии.

В программу обследования супружеских пар, имеющих в анамнезе неудачные попытки ЭКО, необходимо включать молекулярно-генетическое обследования для выявления низкофункциональных аллелей генов фолатного обмена и генов II системы детоксикации.

Заключение

Дальнейшие исследования генотипа бесплодных супружеских пар позволит формировать оптимальную тактику ведения этих пациентов. При выявлении хромосомной и моногенной патологии у родителей целесообразно применять предимплантационную диагностику для профилактики рождения больного потомства.