Журнал «Медико-социальные проблемы семьи» 2 (том 17) 2012

Розшифровка людського генома відкрила еру геноміки та поставила численні питання, які потребують пояснень. Виявлено, що 99% геному людини становлять повторювані некодовані послідовності нуклеотидів. Ці послідовності створюють передумови для нестабільності геному та, найімовірніше, є джерелом еволюції людського виду. Нестабільність генома є причиною транслокацій, мутацій, поліморфізму, індукує патологічні процеси, у тому числі – безплідність [4].

Зв'язок SS варіанту гену FSHR зі зниженою фертильністю жінок відомий досить давно [2, 9]. На сьогодні відомо вже 911 однонуклеотидних функціональних поліморфізмів у гені FSHR. Переважна їх більшість належить до інтронних ділянок гену і лише невелика кількість – до екзону, тобто кодуючої ділянки. Досліджений поліморфізм rs 6166 є наслідком заміни аденіну (А) на гуанідін (G) у позиції 2039 що веде до заміни аспарагіну на серин у кодоні 680. Це веде до зміни фенотипу у вигляді зниження експресії рецептора, більш вираженого при гомозиготному стані за даним поліморфізмом.

Одним з основних цікавих та дискусійних питань для клінічної практики на сьогоднішній день є вплив генетичних змін FSHR на результати лікування при включенні пацієнток в програми допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ).

Частота поліморфізму FSHR у загальній популяції оцінюється на рівні 0,333, тобто вона є досить поширеною [6, 8]. Частота гетерозиготного варіанту (SN) оцінюється різними авторами від 24% до 50%.

Недавня публікація G. Meduri et al. (2008) присвячена молекулярної патології FSHR [7]. Автори вказують, що маніпуляції з геномом миші дозволили встановити основні закономірності функціонування осі гонадотропінів, але отримані в експерименті дані не можуть бути повною мірою застосовані відносно людини. Вивчення мутацій генів, що кодують структуру гонадотропінів і рецепторів до них дозволяє дати пояснення їхнім фізіологічним ефектам. Так, кореляція клінічного фенотипу пацієнток з результатами досліджень in vitro на тваринах з модельними мутаціями рецепторів, які знижували їх функцію, була підтверджена гістологічними й імуногістологічними дослідженнями біоптатів тканини яєчника, що дозволяє зрозуміти, які стадії розвитку фолікула перебувають під безпосереднім контролем ФСГ. Повна інактивація рецепторів до ФСГ викликає безплідність із блокадою дозрівання фолікулів на препубертатному рівні. Часткова інактивація FSHR характеризується наявністю яєчників нормального розміру, і розвиток фолікулів до антральної стадії, наступний розвиток фолікулів вимагає замісної терапії ФСГ. Успіх лікування безпліддя, таким чином, залежить від наявності фолікулярного резерву. 

Істотні альтерації в експресії рецепторів естрогену ESR-α і ESR-β можуть бути пов'язані з ненормальним розвитком фолікулів [1]. Слід зазначити, що ген ESR2 кодує цілу групу β-рецепторів до естрогенів та надсімейство транскрипційних факторів ядерних рецепторів. У відсутності естрогена, рецептор, зв’язаний з білком теплового шоку HSP90, перешкоджає переходу рецептора в активний конформаційний стан. Приєднання гормону до рецептора викликає дисоціацію комплексу, у результаті чого відбувається зміна конформаційного стану рецептора й передача внутрішньоклітинного сигналу на специфічні фактори транскрипції. Частота різних алельних варіантів у популяції складає для алеля G – 97,3% для алеля A –2,7% [3, 5].

Метою нашого дослідження стало оцінка прогнозування відповіді на контрольовану оваріальну стимуляцію за допомогою тестування на генетичний поліморфізм генів FSHR і ESR2.

Матеріали та методи

Обстежено 130 пацієнток групи ДРТ, у яких під час проходження лікування за програмою ДРТ не розвивався синдром гіперстимуляції яєчників, а також у 99 жінок з нормальною плідністю, з самостійними вагітностями в анамнезі, які закінчилися пологами, контрольної групи К.

Середній вік пацієнток групи І склав 30,65±0,40 років, ІІ – 31,03±0,34, ІІІ – 30,41±0,41 і вірогідно між групами не відрізнявся.

У протоколах ДРТ контрольована стимуляція яєчників для проведення екстракорпорального запліднення виконувалася агоністами ГнРГ та гонадотропінами з використанням довгого протоколу. Десенсибілізації гіпофізу досягали введенням бусереліну ацетату (Супрефакт, «Hoechst», Німеччина). Стимуляція яєчників здійснювалася людським менопаузальним гонадотропіном (Хумегон, «Organon», Нідерланди, або Менопур, «Ferring», Данія). Моніторинг розвитку фолікулів здійснювався методами трансвагінального УЗД та визначення рівнів естрадіолу Е₂ в сироватці крові. Індукція овуляції здійснювалася введенням 10 000 МО ХГл (Прегніл, «Organon», Нідерланди) після того, як щонайменше два фолікули досягали діаметру 18-20 мм. Забір  овоцитів здійснювався методом вагінальної пункції з ультразвуковим контролем через 36 годин. Підтримка лютеїнової фази полягала у щоденному інтравагінальному введенні 3 х 200 мг мікронізованого прогестерону (Утрожестан, «Besins International», Франція), починаючи з дня після забору овоцитів.

Геномна ДНК із зразків крові була виділена за допомогою наборів GenуJet DNA purification Kit (Fermentas). Вимірювання концентрації виділеної із зразків крові ДНК проводили на флюріметре Nanodrop c використанням барвника SybrGreenI. Ампліфіцікацію проводили методом мультиплексної TouchDown ПЛР з HotStartTag DNA Polymerase з використанням набору Maxima Hot Start PCR master mix (Fermentas) і 10 пкмоль специфічних праймерів для аналізованих SNP досліджуваних генів: 95оС 15 хв, 10 циклів 95оС - 30 сек, 65оС -1 хв., з пониженням температури на 1,0 градус/ цикл.; 30 циклів, 95оС 30 сек.; 60оС - 30сек, 72 оС - 45 сек., 72 оС - 10 хв на термоциклер MJR і ICycler. Дизайн праймерів був зроблений за допомогою програми PSQ Assay Desing (Biotage). Синтез праймерів було проведене фірмою Синтол (Росія).

Аналіз SNP був проведений методом піросеквенування з використанням набору Pyro Gold Reagents фірми Qiagen і 0.3 мМ специфічних секвенуючих праймерів до досліджуваних SNP згідно з методикою піросеквенування (Qiagen). Аналіз поліморфізму проводили на приладі PyroMark Q96 MA.

Одержані результати обробляли на ЕОМ типу IВM PC з застосуванням електронної таблиці “Microsoft Excel”.

Результати та їх обговорення

Середній вік пацієнток групи ДРТ склав 31,03±0,34 років, К – 30,41±0,41 і вірогідно між групами не відрізнявся.

Частоти алелей для поліморфізму S⁶⁸⁰N становили 39,39% S і 60,61% N в контрольній групі плідних жінок, 50,77% S і 49,23% N в групі пацієнток програми ДРТ (р_к1<0,02) (табл. 2).

Частоти генотипів гена FSHR в положенні 680 становили 17,17% SS; 44,44% SN і 38,38% NN в контрольній групі жінок; 25,38% SS; 50,77% SN і 23,85% NN в групі пацієнток програм ДРТ (р_к<0,05) (див. табл. 2).

Частоти генотипів гена ESR2 становили 95,00% GG; 2,00% GA і 2,00% AA в контрольній групі плідних жінок; 87,69% GG; 10,00% GA і 2,31% AA в групі пацієнток програм ДРТ (р_к<0,03) (табл. 3). При порівнянні контрольної групи пацієнток програм ЕКЗ з групою пацієнток з СГЯ відмічалося вірогідне зменшення генотипу GG; в 1,41 (р<0,0001) рази і збільшення GA в 3,38 (р<0,0001) рази.

Як видно з табл. 3, частоти алелей для поліморфізму GA гена ESR2 становили 97,97% G і 3,03% А в контрольній групі плідних жінок, 92,69% G і 7,31% А в групі пацієнток програми ДРТ (р_к<0,05).

Цікаві результати були одержані при співставленні частоти зустрічальності різних генотипів у пацієнток з різним ступенем оваріальної відповіді на стимуляцію гонадотропінами у групі ДРТ (рис. 1).

Загальна кількість жінок з низьким рівнем відповіді на стимуляцію за довгим протоколом склала у нашій вибірці 13,08% (17) від загального числа пацієнток (130). Серед пацієнток з низьким рівнем відповіді на оваріальну стимуляцію (менше 3 фоллікулів) найбільш часто зустрічалися генотипи SS і SN за геном FSHR і GA за геном ESR2.

Як видно з рис. 2, у жінок з низьким рівнем відповіді на стимуляцію гонадотропінами в циклі ДРТ у 64,71% випадків зустрічається генотип SS, у 35,29% – генотип SN (за геном FSHR), у 29,41% – генотип GG, у 64,71% – генотип GA, у 5,88% – генотип АА (за геном ESR2).

Висновки

При наявності у жінок з безпліддям сполучення генотипів SS і GG за відповідними генами FSHR і ESR2 ризик несприятливих клінічних виходів (non-response cases) при лікуванні з застосуванням ДРТ збільшується у 1,6 разів (ВШ=1,6; ДІ 95%: 1,4-1,9), а при сполученні гетерозиготних генотипів SN і GA - у 1,9 разів (ВШ=1,9; ДІ: 1,3-2,4). Цю обставину слід враховувати при визначенні ризику клінічно несприятливих виходів при застосуванні репродуктивних технологій, насамперед ДРТ, та при виборі дози медикаментозного препарату, що використовується для стимуляції. Також вищенаведені результати свідчать про те, що генетично детермінований стан рецепторного апарату яєчників є визначальним у реалізації відповіді на стимуляцію препаратами рекомбінантного гонадотропіну, що вимагає широкого впровадження методів молекулярно-генетичних досліджень на етапі планування репродуктологічного втручання у безплідних жінок.