Журнал «» 2 (28) 2013

Проведення початкового етапу дослідження стало можливим завдяки спонсорській допомозі ДП «Укрметр­тестстандарт» на чолі з директором М.Я. Мухаровським та компанії Corporate Finance Valuation & Consulting Services Baker Tilly (Alexander Polyanskiy, MRICS Partner).

Серцево-судинні захворювання — основна причина захворюваності та інвалідізації населення в усіх розвинутих країнах світу, у тому числі і в Україні. Артеріальна гіпертензія (АГ) — основний фактор ризику ішемічної хвороби серця (ІХС) та цереброваскулярних захворювань, що на 88,1 % визначають рівень смертності від хвороб системи кровообігу. Серед осіб із підвищеним артеріальним тиском (АТ) смертність майже у 2 рази вища, ніж серед осіб із нормальним тиском [1]. Майже 30–35 % усього дорослого населення світу страждає від різних форм гіпертензії. У 2010 році АГ стала причиною смерті більше ніж дев’яти мільйонів осіб у всьому світі і є лідером серед причин смертності. За даними офіційної статистики МОЗ України, станом на 1 січня 2011 року зареєстровано більше ніж 12,1 млн хворих на АГ, що становить приблизно 32,2 % дорослого населення країни [2–4].

Результати клінічних та експериментальних досліджень свідчать про залучення стресового білка Hsp60 та антитіл до нього в патогенез серцево-судинних захворювань (ССЗ) [5–13]. Hsp60 — висококонсервативний та високоімуногенний білок, що в мітохондріях забезпечує правильне згортання білків, запобігає їх агрегації та денатурації, у цитоплазмі виконує антиапоптичну функцію [14]. Позаклітинний Hsp60 (локалізований на клітинній поверхні та циркулюючий) є важливою сигнальною молекулою, що здатна активувати Т- та В-лімфоцити, макрофаги, а також індукувати проліферацію В-лімфоцитів, синтез та секрецію інтерлейкінів (ІЛ) — ІЛ-6, -10, -12, ІФН-g тощо [15].

Вплив на організм таких факторів ризику ССЗ, як психоемоційний стрес, інфекції, паління тощо, супроводжується підвищенням експозиції Hsp60 на мембрані ендотеліальних клітин судин [5], кардіоміо­цитів [10], b-клітин підшлункової залози [8]. Підвищений АТ є механічним стресом для ендотелію судин, що також призводить до зростання рівнів мембрано­асоційованого Hsp60 [5]. При довготривалій експозиції Hsp60 на поверхні хемотермостресованих клітин та підвищених рівнях циркулюючого Hsp60 спостерігається продукція специфічних автоантитіл до даного білка. Автоантитіла до Hsp60 людини, а також перехресно-реагуючі антитіла до мікробних Hsp60 можуть спричиняти автоімунну реакцію, спрямовану проти Hsp60, що локалізований на поверхні стресованих клітин [10]. Установлено, що анти-Hsp60 антитіла, ендогенний циркулюючий Hsp60 та їх імунні комплекси здатні індукувати секрецію прозапальних цитокінів ендотеліальними клітинами (фактор некрозу пухлини альфа — ФНП-a, ІЛ-1, -6, -12) [16], що зумовлює рекрутування імунних клітин у зону запалення тканин судин, адгезію моноцитів до ендотелію тощо [17, 18].

Установлено, що підвищені рівні анти-Hsp60 антитіл у сироватці крові є фактором ризику розвитку атеросклерозу [5] та патологічних змін дрібних судин головного мозку [19]. За даними інших авторів [20], вони можуть бути ознакою наявності ССЗ та маркером тяжкості їх перебігу. Антитіла до Hsp60 людини детектуються в підвищених кількостях у сироватці при інсульті, АГ [6, 13]. Підвищені рівні антитіл до мікробних Hsp60, зокрема мікобактеріального Hsp65, виявляються при атеросклерозі сонних артерій [21], гострому інфаркті міокарда [10], пограничній гіпертензії [13]. Специфічність анти-Hsp60 антитіл, а також механізми їх залучення в патогенез ССЗ, зокрема АГ, залишаються остаточно не встановленими.

Метою даної роботи, що є першим етапом дослідження ролі анти-Hsp60 антитіл у розвитку та прогресуванні АГ, було їх виявлення у сироватці пацієнтів з АГ різного ступеня тяжкості та клінічно здорових осіб, родинна історія яких включала випадки АГ по материнській лінії.

Матеріали та методи досліджень

В обстеження були включені 128 осіб, середній вік 48,4 ± 27,6 року. Жінки становили 35,3 %, чоловіки — 64,7 %. Із них 32 пацієнти з АГ, серед яких 19 пацієнтів із 2-ю стадією, 2-го ступеня (помірний додатковий ризик), 13 пацієнтів із 3-ю стадією, 3-го ступеня (високий додатковий рівень ризику) [1, 2]. Із дослідження були виключені хворі з онкологічними захворюваннями, хронічними запальними захворюванням, системними захворюваннями сполучної тканини, цукровим діабетом та іншою тяжкою соматичною патологією, здатною впливати на результати дослідження. У контрольну групу увійшли 12 клінічно здорових осіб із спадково обтяженим анамнезом за АГ за материнською лінією (віком від 22 до 50 років), відібрані 84 донори крові (віком від 20 до 48 років) із низькою реактивністю до Hsp60.

У пацієнтів з АГ підвищений АТ спостерігався від 7 до 20 років. Усі пацієнти з АГ отримували комбіновану антигіпертензивну терапію. Усім пацієнтам до початку лікування та після його закінчення проводили офісне вимірювання систолічного та діастолічного АТ з визначенням частоти серцевих скорочень, добове моніторування АТ, визначення швидкості поширення пульсової хвилі (ШППХ) по артеріях еластичного та м’язового типів за допомогою апарата Complior (Artech Medical, Франція). Збільшення ШППХ асоціюється із погіршенням пружно-еластичних властивостей артерій. Величина більше ніж 12 м/с розцінюється як маркер ураження еластичних артерій, при цьому значно збільшується серцево-судинний ризик. Дуплексне сканування сонних артерій проводили на ультразвуковому діагностичному апараті Medison Sono Ace 9900 («Медісон», Північна Корея). Визначали товщину комплексу інтима-медіа (ТІМ) та наявність атеросклеротичних бляшок в загальній, внутрішній та зовнішній сонній артеріях справа та зліва. Про наявність атеросклеротичної бляшки говорили при локальному збільшені ТІМ до 1,3 мм і більше. Ехокардіографічне дослідження сердця проводили за стандартною методикою. Дослідження включало також офтальмологічний огляд очного дна з описом стану вен та артерій, біохімічне дослідження крові, визначення рівнів калію, натрію, креатиніну, холестерину, тригліцеридів та цукру. С-реактивний протеїн визначали кількісним методом за стандарною методикою. Біохімічні показники крові визначали на автоматичному біохімічному аналізаторі Livia (Cormay, А-25, Польща) та на автоматичному аналізаторі (Ciba Corning, Англія). Швидкість клубочкової фільтрації нирок розраховували за формулою Cockroft — Gault [14].

Рівень анти-Hsp60 антитіл у сироватках пацієнтів до початку лікування визначали методом ELISA [22] з модифікаціями [23]. Як антиген використовували рекомбінантний білок GroEl Escherihia coli (прокаріотний гомолог Hsp60 людини). Одержання та очистку рекомбінантного білка GroEl E.coli проводили за розробленою методикою [24]. Чистоту отриманого рекомбінантного білка контролювали методом електрофорезу у 12 % ПААГ у денатуруючих умовах. Концентрацію рекомбінантного білка визначали за допомогою методу Бредфорд [27]. Антитілопозитивною вважали сироватку, оптична щільність якої в розведенні 1 : 50 перевищувала середнє значення оптичної щільності сироваток донорів на 2 стандартних відхилення (m ± 2 sd). Усі досліджувані сироватки було проскриновано на наявність анти-Hsp60 антитіл одночасно (4 відтворюваних повтори), у статті подані результати останньої постановки ELISA.

Для дослідження реактивності сироваток до Hsp60 методом вестерн-блот аналізу нітроцелюлозу, що містила рекомбінантний білок GroEl E.coli, розрізали на однакового розміру смужки (кожна з них містила 50 мкг білка). Забивка молоком на 1 годину (2 г молока на 40 мл PBSт), інкубували їх окремо в спеціальних планшетах однакової ширини з дослідними сироватками у розведенні 1 : 50 протягом ночі при 4 °С і поміщали на широку доріжку. Інкубація з кон’югатом (anti-human 1 : 4000 ) на 2 год.

Вестерн-блот аналіз проводили за стандартною методикою з використанням одержаних нами поліклональних анти-GroEl антитіл (3 відтворюваних повтори, у статті подані результати останньої постановки досліду).

Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою пакету програм Statistica 8.0 (Stat-Soft, 2007, США). Результати наведені у вигляді середніх значень (m) із вказівкою на стандартне відхилення (sd). Для порівняння вибірок досліджуваних груп використовували U-критерій Манна — Уїтні (Mann — Whitney U-test).

Результати досліджень та їх обговорення

Із 112 обстежених донорів крові було відібрано 84 донори, сироватки яких за результатами ELISA та вестерн-блот аналізу мали низьку реактивність до Hsp60. Ці донори становили контрольну групу із дослідження рівнів анти-Hsp60 антитіл за АГ різного ступеня тяжкості.

За результатами ELISA анти-Hsp60 позитивні сироватки у групі клінічно здорових осіб, родинна історія яких включала випадки АГ, виявлені у 58,3 %; у групі пацієнтів з АГ 2-ї стадії — у 73,6%; у групі пацієнтів з АГ 3-ї стадії — у 50 %. Індивідуальні показники тестування сироваток наведені на рис. 1.

Анти-Hsp60 позитивною вважали сироватку, оптична щільність якої перевищувала середнє значення оптичної щільності клінічно здорових донорів на 2 стандартних відхилення. Як видно з рис. 1, найбільш низьку реактивність сироватки до Hsp60 мали відібрані донори, а зі зростанням ступеня АГ та появою додаткового помірного чи високого ризику відповідно зростає реактивність сироватки до Hsp60.

Середні рівні анти-Hsp60 антитіл у всіх досліджуваних груп пацієнтів вдвічі перевищували показник контролю (р = 0,007972; р = 0,000111; р < 0,000001 відповідно) (табл. 1). Середні рівні С-реактивного білка, креатиніну, ТІМ не відрізнялися від показників контролю. Частотний аналіз показав, що рівень С-реактивного білка в пацієнтів з АГ перевищував показники норми на 47,6 %, рівень креатиніну — на 23,8 %, ТІМ — 66,6 %.

У всіх клінічно здорових осіб, родинна історія яких включала випадки АГ, зазначені показники знаходилися в межах норми.

Нами не виявлено кореляції між рівнями анти-Hsp60 антитіл та С-реактивного білка, креатиніну в обстежених пацієнтів (p > 0,05) (табл. 2). Разом із тим рівень С-реактивного протеїну при АГ 3-го ступеня значно вищий (р < 0,001), ніж у групі контролю. Pockley et al. (2000, 2003) показали, що рівень Hsp60, але не антитіл до нього корелював із ТІМ. За даними літератури, установлено кореляцію між ТІМ та рівнем С-реактивного білка (Sitzer et al., 2002; Winbeck et al., 2002; Van Der Meer et al., 2002), між ТІМ та віком, рівнем фібриногену, ФНП-a (Jastrzebski et al., 2006).

Інші автори, навпаки, не виявили такої кореляції (Folsom et al., 2001). Ступінь потовщення ТІМ прямо пов’язаний зі ступенем перебігу АГ та тривалістю існування підвищеного AT. Для вивчення взаємозв’язку анти-Hsp60 антитіл залежно від ступеня атеросклеротичних уражень магістральних судин за показниками ШППХ та товщини комплексу ІМ усі хворі боли розподілені на дві підгрупи. У першу підгрупу (I) увійшли 17 хворих на АГ, у яких за даними ШППХе не визначено ознак порушення пружно-еластичних властивостей артерій, другу підгрупу (II) становили хворі з ознаками атеросклеротичних уражень магістральних артерій, тобто зі швидкістью поширення пульсової хвилі більше ніж 12 м/c (табл. 3).

Як видно з табл. 3, рівні анти-Hsp60 антитіл достовірно вищі в підгрупі зі значними порушеннями пружно-еластичних властивостей магістральних артерій за показниками ШППХе та комплексу ІМ, що свідчить про можливий потенціюючий вплив анти-Hsp60 антитіл на процес ураження еластичних артерій.

За допомогою вестерн-блот аналізу досліджували високореактивні до Hsp60 (за результатами ELISA) сироватки пацієнтів з АГ 2-ї (n = 7) та 3-ї стадії (n = 5), клінічно здорових осіб, родинна історія яких включала випадки АГ (n = 6), а також донорів крові (n = 4, із них у трьох випадках сироватки низькореактивні до Hsp60 та в одному — сироватка високореактивна до Hsp60) (рис. 2). Як свідчать дані рис. 2, антиген-мішень (Hsp60) розпізнавали дві з семи сироваток пацієнтів із АГ 2-ї стадії (доріжки 16 та 17) та чотири з п’яти сироваток пацієнтів з АГ 3-ї стадії (доріжки 18, 19, 20 та 22). За клінічними показниками ці пацієнти незалежно від стадії були віднесені в групу дуже високого ризику розвитку ускладнень.

Сироватки решти обстежених пацієнтів з АГ 2-ї стадії (доріжки 11–15) та 3-ї стадії (доріжка 21) проявляли низьку реактивність до Hsp60. За клінічними показниками пацієнти з АГ 2-ї стадії мали більш сприятливий прогноз, тоді як пацієнт з АГ 3-ї стадії був за клінічними показниками у групі дуже високого ризику розвитку ускладнень. Слід зазначити, що сироватка однієї з клінічно здорових осіб, родинна історія яких включала випадки АГ, проявляла високу реактивність до Hsp60 (доріжка 9).

Дані літератури щодо виявлення анти-Hsp60 антитіл за АГ нечисленні. Показано, що при АГ підвищувався вміст антитіл до мікобактеріального Hsp65, тоді як уміст антитіл до Hsp60 людини достовірно не відрізнявся від показників контролю (Frostegard et al.,1997; Pockley et al., 2000). Jastrzebski М. et al. також не виявили зростання рівнів антитіл до Hsp60 людини, на їх думку, підвищення експозиції Hsp60 на стресованих ендотеліальних клітинах судин при АГ не супроводжується автоімунною реакцією, опосередкованою анти-Hsp60 антитілами (Jastrzebski et al., 2006). Навпаки, Zhang et al. (2008) детектували статистично достовірне підвищення вмісту антитіл до Hsp60 людини при АГ порівняно з контролем; вони показали, що при поєднанні АГ та високих концентрацій даних антитіл ризик розвитку ССЗ зростає в 4 рази. За даними Frostegard et al. (1998), при пограничній гіпертензії достовірно підвищуються рівні IgM та IgG антитіл до ендотеліальних клітин. Такі антитіла можуть ініціювати утворення атеросклеротичних бляшок, активувати комплемент, накопичення імунних комплексів, індукувати молекули клітинної адгезії, забезпечувати рекрутування фагоцитуючих клітин тощо. Показано прямий зв’язок між рівнем антитіл до ендотеліальних клітин у пацієнтів із пограничною гіпертензією та рівнем ендотеліну, який є потужним судинозвужуючим агентом (Luscher et al., 1995; Frostegard et al., 1998). Антитіла до ендотеліальних клітин індукували секрецію ендотеліну в культурі ендотеліальних клітин людини (Yoshio et al., 1995). Підвищення АТ може опосередковуватися антитілами до ендотеліальних клітин за рахунок підвищення продукції ендотеліну. Висловлюється припущення, що рівень даних антитіл може бути маркером дисфункції ендотелію у клінічно здорових осіб (Frostegard et al., 1998). На сьогодні встановлено, що антитіла до ендотеліальних клітин — це гетерогенна група антитіл проти різних білків ендотеліальної мембрани (Tobon et al., 2009). Одним із таких білків-мішеней, які розпізнаються антитілами до ендотеліальних клітин, є Hsp60 (Dieude et al., 2004).

Антитіла до мікробних Hsp60 можуть використовуватись як діагностичний маркер при деяких захворюваннях. Так, наявність антитіл до амінокислотних залишків (а.з.) 141-160 Hsp60 Helicobacter pylori асоційована з серцево-судинними захворюваннями у людини [8]. Антитіла до Hsp65 M.tuberculosis вважаються прогностичним маркером розвитку і прогресування атеросклерозу у клінічно здорових людей [7]. Наявність антитіл до Hsp60 Streptococcus pyogenes (а.з. 357-368 та 418-427) асоційована з розвитком глаукоми [22]. Антитіла до хламідійного Hsp60 є ознакою хронічної або персистентної хламідійної інфекції, пов’язані з високим ризиком розвитку трубних порушень, ектопічної вагітності, втрати вагітності на ранніх стадіях, передчасних пологів, низької результативності запліднення in vitro [10, 16, 23–25].

Поєднане використання методів ELISA та вестерн-блот аналізу для виявлення анти-Hsp60 антитіл може бути додатковим діагностичним підходом для прогнозування характеру перебігу АГ та ризику розвитку ускладнень. На нашу думку, наявність у пацієнтів з АГ 3-ї стадії підвищених рівнів досліджуваних антитіл та виражених змін органів-мішеней (в анамнезі — масивні повторні крововиливи в сітківку ока, гостре порушення мозкового кровообігу ішемічного типу, кардіосклероз, ангіонефросклероз) може свідчити про залучення анти-Hsp60 антитіл у розвиток уражень органів-мішеней. Раніше було показано, що у пацієнтів з АГ з ушкодженими органами-мішенями (серце, нирки, судини) порівняно з пацієнтами з АГ без ушкоджень органів-мішеней спостерігались достовірно вищі рівні в сироватці маркерів запалення (С-реактивного білка, фібриногену, фактора некрозу пухлини a, ІЛ-6, розчинного рецептора фактора некрозу пухлини a типу 2) (Jastrzebski et al., 2006; Batistta et al., 2005; Morillas et al., 2012) та апоптозу (розчинного рецептора фактора некрозу пухлини a типу 1, розчинного Fas-рецептора) (Morillas et al., 2012). Анти-Hsp60 IgG антитіла, афінно-очищені з високореактивних до Hsp60 сироваток пацієнтів із системним червоним вовчаком, зв’язували Hsp60 на поверхні ендотеліальних клітин та індукували їх апоптоз (Dieude et al., 2004). Анти-Hsp60 антитіла здатні індукувати продукцію прозапальних цитокінів та молекул клітинної адгезії ендотеліальними клітинами (Mandal et al., 2004; Xu et al., 2000; Chen et al., 1999).

На основі отриманих нами результатів та аналізу даних літератури ми припустили, що анти-Hsp60 антитіла (як автоантитіла до Hsp60 людини, так і перехресно-реагуючі антитіла до мікробних Hsp60) можуть бути залучені у патогенез АГ (рис. 3).

За рахунок високої гомології між про- та еукаріотним Hsp60 перехресно-реагуючі антитіла до мікробних Hsp60 здатні розпізнавати епітопи Hsp60, локалізованого на мембрані стресованих клітин (викликаючи їх лізис або апоптоз (Capello et al., 2009)). Експериментально було показано, що анти-Hsp60 антитіла викликали лізис стресованих ендотеліальних клітин in vitro у присутності комплементу (комплемент-залежна цитотоксичність) (Schett et al., 1995). Гіпертензія вважається одним з основних факторів ризику розвитку атеросклерозу (Frostegard et al., 1998). «Антигенна мімікрія» може спричиняти ендотеліальні пошкодження та ранні атеросклеротичні бляшки (Wick et al., 2004; Mandal et al., 2004). Експериментально встановлено, що наявність підвищених рівнів антитіл до мікробних Hsp60 підсилює утворення тромбів (Dieude et al., 2010). Порушення цілісності ендотелію судин у результаті взаємодії анти-Hsp60 антитіл з Hsp60, експресованим на мембрані стресованих ендотеліальних клітин, може бути однією з причин геморагічних інсультів та геморагій в сітківку ока, ангіонефросклерозу з розвитком ниркової недостатності. Крім безпосередньо ендотеліально-судинних ушкоджень, анти-Hsp60 антитіла здатні формувати імунні комплекси з циркулюючим Hsp60, які безпосередньо ушкоджують базальну мембрану капілярів клубочків, викликаючи її ензимну перфорацію, що на фоні високого тиску та гіперфільтрації прискорює процес розвитку гіпертензивного нефросклерозу.

Висновки

1. Уперше визначено підвищення рівня анти-Hsp60 антитіл (анти-Hsp60 позитивні сироватки) у клінічно здорових осіб, родинна історія яких включала випадки АГ (методом ELISA).

2. Зі збільшенням ступеня перебігу АГ від помірного до тяжкого достовірно підвищується рівень анти-Hsp60 антитіл.

3. Атеросклеротичне ураження магістральних судин у хворих на артеріальну гіпертензію спостерігається лише у хворих із вискоим рівнем анти-Hsp60 антитіл.

4. Поєднання методів ELISA та вестерн-блот аналізу для дослідження реактивності сироваток до Hsp60 може бути використаним для прогнозування характеру перебігу артеріальної гіпертензії.