Журнал «Почки» 2 (04) 2013

Вступ

За світовими даними, інфекції сечових шляхів (ІСШ) посідають перше місце серед всіх госпітальних інфекцій, становлячи близько 30–40 % випадків. Головна причина їх виникнення — використання уретральних катетерів, що зазвичай із різних причин потрібно застосовувати у хворих, які знаходяться у відділеннях інтенсивної терапії [1]. У пацієнтів цих відділень до 95 % всіх ІСШ припадає на частку катетер-асоційованих, що значно збільшує показники смертності [2, 9]. Навіть при короткотерміновій катетеризації в 15–30 % пацієнтів розвивається бактеріурія. Частота бактеріурії, викликаної уретральними катетерами, може досягати 10 % на добу [8], отже, перебування хворих у відділеннях інтенсивної терапії постійно пов’язане з ризиком розвитку ІСШ.

Особливість патогенезу катетер-асоційованих інфекцій полягає в тому, що, з одного боку, штами бактерій — потенційних збудників запального процесу мають здатність до адгезії. З іншого боку, сама установка катетера та його анатомічне розташування створюють умови для заселення мікробів на катетери з подальшим утворенням біоплівки [4, 5]. Це призводить до великих труднощів у лікуванні госпітальної інфекції, а в ряді випадків і до летальних наслідків [6].

Найбільш частими збудниками є Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Candida spp. тощо, у 15 % випадків виділяється полімікробна флора. Слід відмітити, що характер мікрофлори в катетеризованих пацієнтів змінюється із тривалістю захворювання та катетеризації [7].

Незважаючи на застосування нових медикаментозних препаратів, частота ІСШ не має тенденції до зниження. Це обумовлює постійний пошук та впровадження препаратів, що проявляють не тільки антимікробну дію, але й справляють антиадгезивний ефект, тобто запобігають адгезії, розмноженню та персистенції мікроорганізмів у системі сечовивідних шляхів. Завдяки вчасним та належним терапевтичним заходам можливо значно зменшити ризик розвитку інфекцій сечовивідних шляхів.

Незважаючи на те що антибіотики використовуються для лікування та профілактики інфекції сечових шляхів, часте їх застосування може призвести до вагінального та кишкового дисбактеріозу, а також до стійкості мікроорганізмів. Таким чином, бажано шукати альтернативні методи лікування, що давали б антимікробний та антиадгезивний ефект. Ці методи можуть включати використання рослинних або біологічно активних добавок на фруктовій основі, таких як журавлина, за умови, що їх ефект науково обґрунтовується дослідженнями рівня А, зокрема подвійними сліпими і плацебо-контрольованими.

Попередні дослідження екстракту сушених квіток Hibiscus sabdariffa (HS) показали ефективність для лікування і профілактики рецидивуючого циститу. Було показано, що ці багаті антоціаном екстракти та їх глікозильовані форми (зокрема, самбубіосиди, проантоціанідини і флавоноїди) інгібують у пробірці ріст колоній E.coli і Candida аlbicans як у рідкому, так і твердому середовищах.

Біодоступність сполук, що містяться в екстрактах HS, у сечі була доведена у щурів. Дослідження за допомогою високоефективної рідинної хроматографії ліофілізованої сечі щурів, які отримували дієту, збагачену екстрактом чашечок гібіскусу, показали наявність антоціанінових фенольних, флавоноїдних і фенольних кислотних сполук, типових для екстракту, хроматографічний профіль якого відповідає первинним екстрактам, що додавали до дієти.

На впровадження в практику екстракту сушених квіток Hibiscus sabdariffa вплинуло проведення подвійного сліпого контрольованого рандомізованого клінічного дослідження частоти епізодів рецидиву циститу в жінок.

Результати цього дослідження засвідчують, що екстракт сушених чашечок Hibiscus sabdariffa дійсно може використовуватися для профілактики рецидивуючих ІСШ за типом циститу.

Ця ефективність пов’язана з цілим рядом факторів. По-перше, фенольні сполуки, виявлені в екстракті HS, можуть пригнічувати ріст E.coli і C.аlbicans. Восьмиразове зменшення зростання E.coli і п’ятиразове —C.аlbicans протягом 24 годин спостерігалося при концентраціях, аналогічних стандартній дозі.

По-друге, сліди фенольних сполук рослинного походження, а саме флавоноїди і похідні самбубіосидових антоціанових і фенольних кислот, які, як вважається, відповідають за пригнічуючий ефект на мікробну флору, мають високу біодоступність. Ця біодоступність була продемонстрована за допомогою аналізу сечі через 2 години після прийому. Це передбачає, що шлях проходження складовими препарату ниркового й інтестинального бар’єрів і досягнення просвіту сечового міхура відповідає часу контакту з препаратом, необхідному для дії його на місці, з урахуванням частоти сечовипускань і об’єму сечі, що викликає швидке розбавлення препарату у сечовивідних шляхах.

Антибактеріальна дія екстракту також пов’язана з іншими механізмами. Екстракти Hibiscus sabdariffa містять протокатехову кислоту, антибактеріальний ефект якої заслуговує на окрему увагу.

У результаті цих досліджень був створений унікальний продукт — UTIRosе™: UTI — в перекладі з англійської означає «інфекція сечовивідних шляхів», Rose — початок англійської назви рослини — Roselle, або гібіскус (Hibiscus sabdariffa), із якого цей продукт отримано.

У 2012 р. у Женеві, Швейцарія, екстракт UTIRose^тм отримав приз «Найбільш інноваційний інгредієнт року». Провідні експерти та вчені в рамках проекту «Нагороди у партнерстві з Vitafoods Європа», що заохочує видатні досягнення маркетингу, бізнесу й технологій нутрицевтиків, визначили екстракт UTIRose^тм як переможця за критеріями технічного прогресу, наукової обґрунтованості, вигоди і широти застосування.

На території України екстракт UTIRose^тм представлений лікарським засобом Афлазин^®, реєстраційне посвідчення UA/11171/01/01, Наказ МОЗ № 128 від 15.02.2013.

Мета дослідження: вивчити вплив препарату Афлазин^® та окремо його комбінації з левофлоксацином на адгезивні властивості мікроорганізмів.

Матеріали та методи

Вивчення адгезивних властивостей проводили на клінічних ізолятах мікроорганізмів, виділених із сечі хворих із катетер-асоційованими ІСШ, які перебували у відділеннях реанімації та інтенсивної терапії різних лікувальних закладів м. Києва.

Адгезивну активність мікроорганізмів вивчали на еритроцитах людини резус-позитивної 0 (I) групи крові за методикою, запропонованою В.І. Бріліс (1986 р.). Універсальність даної моделі полягає в тому, що еритроцити мають на своїй поверхні глікофорин — речовину, ідентичну глікокаліксу епітеліальних клітин, на якому розташовані рецептори для адгезинів мікробів [10]. Для вирощування культур мікроорганізмів використовували триптиказосоєвий бульйон та бульйон Сабуро для грибів роду Candida (виробництва BioMerieux, Франція). Перед використанням еритроцити двічі відмивали 0,1 М розчином фосфату натрію шляхом центрифугування при 3000 об/хв протягом 15 хв. На буфері готували завись еритроцитів, що мала концентрацію 10⁸ клітин/мл. Культури інкубували в термостаті при 37 °С протягом 24 год. Для постановки досліду в U-подібні мікропланшети вносили по 0,1 мл суспензії мікроорганізмів із концентрацією 10⁹ КУО/мл і по 0,1 мл зависі еритроцитів. Суміш інкубували при температурі 37 °С, час від часу струшували, упродовж 30 хвилин. Після цього на знежиреному предметному склі готували мазок, що висушували при кімнатній температурі, фіксували та фарбували за методом Паппенгейма [3]. Адгезивні властивості досліджуваних мікроорганізмів вивчали на отриманих препаратах під світловим мікроскопом.

Інтерпретацію результатів проводили за середнім показником адгезії (СПА) — середня кількість мікроорганізмів, прикріплених до одного еритроцита, при підрахунку 25 еритроцитів, враховуючи не більше 5 еритроцитів у полі зору. На підставі цих показників розраховували індекс адгезивності мікроорганізмів (ІАМ) за формулою: ІАМ = СПА ґ 100 / КА.

Щодо критеріїв оцінки адгезивних властивостей, то мікроорганізм вважають неадгезивним при ІАМ Ј 1,75; низькоадгезивним — від 1,76 до 2,5; середньоадгезивним — від 2,51 до 4,0; та високоадгезивним при ІАМ більше ніж 4,0.

Мінімальну інгібуючу концентрацію діючої речовини UTIRose^тм (гібіскусу екстракту сухого) визначали методом серійних розведень із встановленням субінгібуючої концентрації, яку в подальшому використовували в дослідній роботі. Вплив діючої речовини препарату Афлазин^® (гібіскусу екстракту сухого) в концентрації 200 мг/мл на адгезивні властивості мікроорганізмів визначали шляхом додавання в лунки мікропланшета разом із приготованою сумішшю еритроцитів та суспензії мікроорганізмів за вищенаведеною методикою. Як контроль використовували добові культури мікроорганізмів вищеперерахованих клінічних ізолятів, вирощених на відповідних поживних середовищах.

Отримані кількісні результати досліджень піддавали статистичній обробці загальноприйнятими методами варіаційної статистики з розрахунком середньої арифметичної (М), середньоквадратичного відхилення (s), помилки середньої арифметичної (m), оцінювали вірогідність розбіжностей за критерієм Cтьюдента (t), з урахуванням рівня значущості (р).

Результати та їх обговорення

У табл. 1 наведено результати щодо дослідження впливу діючої речовини препарату Афлазин^® та його комбінації з левофлоксацином на середній показник адгезії.

Як видно з табл. 1, найбільш високі показники СПА продемонстрували штами P.aeruginosa, E.fecium та Pantoea spp. — від 5,0 ± 0,3 до 6,0 ± 0,3. Майже вдвічі меншим виявився показник СПА для штамів видів C.albicans та E.faecalis. Додавання діючої речовини препарату Афлазин^® (UTIRose^тм) у концентрації 200 мг/мл призвело до значного та для всіх досліджених штамів вірогідного порівняно з контролем зниження показників СПА. Особливо це стосувалось штамів, у яких показники СПА в контролі були вищими. Так, для штаму E.fecium середня кількість адгезованих на одному еритроциті мікробних клітин при додаванні UTIRose^тм зменшилася у 2,7 раза — із 6,0 ± 0,3 до 2,2 ± 0,2; для штаму P.aeruginosa — у 4,2 раза — із 5,0 ± 0,3 до 1,2 ± 0,1; а найбільше, у 5 разів, для штаму Pantoea spp. — від 6,0 ± 0,3 до 1,2 ± 0,1. Додавання комбінації діючої речовини препарату Афлазин^® (UTIRose^тм) та левофлоксацину призводило до ще більшого зниження показників СПА для зазначених штамів. Порівняно з показниками СПА, отриманими при додаванні винятково UTIRose^тм, вони зменшились у 2–3 рази. Кількісний показник СПА підраховано при мікроскопічному дослідження препаратів при проведенні різних варіантів постановки експерименту (рис. 1–3).

Щодо штамів видів C.albicans та E.faecalis, то показник СПА у них був значно меншим порівняно з іншими дослідженими видами мікроорганізмів та становив 2,6 ± 0,2 та 2,0 ± 0,2 відповідно. Однак і для цих штамів додавання активно діючої речовини препарату Афлазин^® (UTIRose^тм) призводило до суттєвого (р Ј 0,05) зниження кількості адгезованих мікробних клітин на одному еритроциті — в 1,4 та 1,7 раза відповідно для C.albicans (рис. 4) та E.faecalis. Крім того, у випадку з E.faecalis додавання активно діючої речовини разом з антибіотиком ще більше підсилювало ефект щодо зниження СПА до 1,0 ± 0,1, тобто у два рази порівняно з контролем.

За вищенаведеною формулою підраховували індекс адгезивності досліджених мікроорганізмів, що враховує не тільки кількість прикріплених до одного еритроцита мікробних клітин, але й число задіяних у процесі еритроцитів, а також оцінювали адгезивні властивості за прийнятими критеріями. Усі бактеріальні штами досліджуваних мікроорганізмів розцінювалися як високоадгезивні, оскільки мали ІАМ, що перевищував 4,0. Штам C.albicans з ІАМ 3,7 віднесено до середньоадгезивних.

Досліджували вплив на процес адгезії та показник ІАМ активно діючої речовини препарату Афлазин^® (UTIRose^тм) та окремо UTIRose^тм й антибіотика. Результати наведені у табл. 2. Як видно з табл. 2, додавання діючої речовини призводило до зниження показника ІАМ для всіх досліджених штамів мікроорганізмів в 1,6–1,9 раза. Виключенням був штам Pantoea spp., для якого внесення гібіскусу призвело до зниження ІАМ в 6,7 раза — із 6,7 ± 0,3 до 1,0 ± 0,1. Внесення в реакційну суміш комбінації UTIRose^тм та антибіотика левофлоксацину не впливало на процес адгезії порівняно з додаванням винятково UTIRose^тм. Показники ІАМ, за винятком штаму P.aeruginosa, виявилися навіть дещо вищими порівняно з впливом діючої речовини препарату, але це не було статистично вірогідним.

Висновки

1. Штами мікроорганізмів різних таксономічних груп, виділені від хворих із катетер-асоційованими інфекціями сечовивідних шляхів, виявили адгезивні властивості. Так, досліджені бактеріальні штами розцінені як високоадгезивні (ІАМ і 4,0), штам C.albicans з ІАМ 3,7 віднесено до середньоадгезивних.

2. У дослідах in vitro показано, що додавання діючої речовини препарату Афлазин^® (UTIRose^тм) призводить до суттєвого (р Ј 0,05) зменшення показників адгезії мікроорганізмів: в 1,4–5,0 раза порівняно з контролем зменшився середній показник адгезії, в 1,6–6,7 раза знизився індекс адгезивності мікроорганізмів.

3. Застосування комбінації діючої речовини препарату Афлазин^® (UTIRose^тм) із левофлоксацином у субінгібуючій концентрації не призводило до додаткового статистично вірогідного зменшення показників адгезії. Для досліджуваних культур установлено тенденцію до зниження кількості адгезованих на одному еритроциті бактерій порівняно із застосуванням виключно UTIRose^тм, тоді як індекс адгезивності мікроорганізмів практично не відрізнявся.

4. Очевидно, що застосування комбінації препарату Афлазин^® (UTIRose^тм) із левофлоксацином у терапевтичній концентрації забезпечуватиме найбільш повний вплив на збудників інфекцій сечовивідних шляхів завдяки комбінації антимікробної дії антибіотика та зниження адгезії мікроорганізмів під впливом UTIRose^тм.

Конфлікт інтересів: не заявлений.

Рецензент: проф., д.м.н. Зарицький Анатолій Мінович, зав. відділом лабораторії кишкових інфекцій Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського.