Журнал «Медико-социальные проблемы семьи» 2 (том 18) 2013

Ендометріоїдні цистаденоми (ендометріоми) згідно з переглянутою Міжнародною гістологічною класифікацією Всесвітньої організації охорони здоров’я (1999) відносять [16] до групи поверхневих епітеліально-стромальних пухлин (1.3. Ендометріоїдні пухлини (з лусковою диференціацією та без такої), 1.3.1. Доброякісні (цистаденома, аденофіброма)).

Ендометріоми є досить поширеною гінекологічною патологією й реєструються в 11,3–31,1 % жінок, прооперованих із приводу об’ємних утворень яєчників [1]. Питання їх морфогенезу та пухлинних властивостей залишаються до кінця не вивченими.

Вважається перспективним застосування мічених лектинів у визначенні змін клітинних мембран і структури секреторних глікокон’югат при патологічних процесах, у тому числі при пухлинному рості, тому що забагато асоційованих із пухлинами антигенів є біополімерами, які вміщують вуглеводи [5, 8, 12]. Лектини — це група білків неімунного походження, які мають загальну властивість розпізнавати, зворотно і вибірково зв’язувати вуглеводи та вуглеводні детермінанти комплексів вуглеводів із глікокон’югатами і є посередником важливих процесів адгезії та комунікації як усередині, так і за межами клітин [5, 7, 11, 14, 21, 23]. Посилення спорідненості до лектинів може бути обумовлене зменшенням ступеня міжклітинного зв’язку пухлинних клітин і виявленням вуглеводних детермінант зовнішнього шару цитолеми, що робить можливим проникнення лектинів у середину клітини і осідання їх на відповідних вуглеводних фрагментах цитозолю. Збільшення кількості рецепторів пояснюють незавершеністю остаточного глікозилювання рецепторів лектинів, у зв’язку з цим порушення метаболізму в пухлинній клітині. Зростання проліферативної активності пухлин супроводжується підвищенням кількості рецепторів лектинів у клітинах [6]. Доцільно застосування лектиногістохімії для вивчення рецепторного складу лектинів і вуглеводних детермінант із метою з’ясування можливих патогенетичних механізмів виникнення ендометріом яєчників.

Одним з важливих регуляторів клітинного циклу, а також проліферації клітин є PCNA — ядерний антиген клітинної проліферації (Proliferating Cell Nuclear Antigen), який являє собою кофактор ДНК d-полімерази і має масу 36 кДа. Він відіграє важливу роль у синтезі ДНК та ініціації клітинної проліферації, синтезується в пізній фазі G1 і S клітинного циклу і таким чином значною мірою корелює з клітинним розмноженням [19]. PCNA знайдений при імуногістохімічній обробці парафінових секцій нормальних і малігнізованих тканин молочної залози, шлунка, підшлункової залози, передміхурової залози, яєчників [13, 15, 17, 18, 22]. У регуляції активності PCNA відіграють роль фактори росту та інші стимулятори проліферації [9, 20]. Виявлено, що в яєчниках корів в антральних фолікулах є накопичення PCNA-позитивних клітин [10]. Ендометріоми мають різну вираженість експресії PCNA [2]. Вивчення активності PCNA в стінках ендометріом може сприяти визначенню їх проліферативних властивостей.

Метою дослідження стало вивчення морфофункціональних і пухлинних властивостей ендометріом яєчників.

Матеріал та методи

Проведено гістологічне дослідження операційних матеріалів від 30 жінок з ендометріомами яєчників та біоптатів яєчників від 20 жінок контрольної групи з трубною безплідністю.

Операційний матеріал залежно від подальших досліджень фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну (рН 7,4), суміші Карнуа або заморожували при t –20 °C. Дослідження проводили із застосуванням методики ступінчастих зрізів. Зрізи виготовляли товщиною 4–5 мкм і поміщали по 3–4 на стекла Super Frost^® Plus (Німеччина). Парафінові зрізи забарвлювали гематоксиліном та еозином і за Ван Гізоном.

Проводили гістохімічне дослідження ендометріом [3, 4].

Для виявлення глікогену, нейтральних глікопротеїнів у депарафінованих за стандартною методикою зрізах застосовували PAS-реакцію з Шифф-перійодною кислотою (PAS-реакція). Забарвлені зрізи поміщали в канадський бальзам. PAS-позитивні речовини забарвлювалися в рожево-фіолетовий колір різних відтінків (нейтральні глікопротеїни більше світлим кольором, глікоген був більш темним і гранулярним). Наявність нейтральних глікопротеїнів свідчила про зрілість сполучної тканини.

Для виявлення кислих глікопротеїнів застосовували забарвлення депарафінізованих зрізів альціановим синім: для виявлення несульфатованих кислих глікопротеїнів — при pH = 2,5, сульфатованих кислих глікопротеїнів — при pH = 1. Забарвлені зрізи поміщали в канадський бальзам. Кислі глікопротеїни забарвлювалися альціановим синім в синьо-зелений колір і свідчили про наявність молодої сполучної тканини.

Для вивчення ліпідів заморожені зрізи фіксували у формаліні, споліскували спиртом, забарвлювали лужним суданом за Герксгеймером, поміщали в гліцерин. Ліпіди забарвлювалися в жовто-коричневий колір.

Для виявлення естерази, ферменту, що розщеплює жир, виготовлені в кріостаті зрізи інкубували при кімнатній температурі з b-нафтилацетатом, забарвлювали гематоксиліном, промивали в проточній воді, поміщали в гліцерин. Естераза забарвлювалася в коричневий колір.

Для дослідження лужної фосфатази, що бере участь у гормоноутворенні, операційний матеріал фіксували в 10% нейтральному формаліні, виявляли активність ферменту методом азосполучення з b-нафтилфосфатом. Лужна фосфатаза забарвлювалася в чорний колір.

Уміст кислої фосфатази вивчали в зразках, зафіксованих у 10% нейтральному формаліні та витриманих у кріостаті. Виявляли активність ферменту методом азосполучення. Кисла фосфатаза забарвлювався в темно-коричневий колір.

Наявність пероксидази досліджували в заморожених зрізах, забарвлених за Віламаном і Манчіні та поміщених в канадський бальзам.

Для виявлення глікокон’югат використовували набір помічених пероксидазою лектинів різної вуглеводної специфічності. Лектини були виготовлені в лабораторії «Лектинотест» із сировини Карпатського регіону (Львів, Україна): LCA — лектин насіння сочевиці (Lens culinaris lectin) (специфічність — аMan > аGlc); WGA — зародків пшениці (Triticum wulgare agglutinin) (NAcDGlc > NAcNeu); LAL — кори золотого дощу (Laburnum anagyroides lectin) (аL-Fuc); SBA — насіння сої (Soy-bean agglutinin) (NAcDGal); PNA — насіння арахісу (Peanuts agglutinin) (в-D-Gal-H ® 3, DGal NAcD-Gal); HPA — виноградного слимака (Helix pomatia agglutinin) аNAcDGal, NAcGlc); SNA — кори бузини чорної (Sambucus nigra agglutinin) (Neu 5AC/2 ® 6Gal); VAL — омели (Viscum album lectin) (DGal).

Виявлення рецепторів ядерного фактора проліферації (Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)) проводили імуногістохімічним методом за допомогою тест-систем DakoCytomation EnVision (США), HRP (пероксидаза хрону) двоступінчастим методом забарвлення за інструкціями фірми з мишиними моноклональними антитілами до PCNA Dako (США).

Виготовлені гістологічні препарати вивчали за допомогою світлового мікроскопа Olympus BX-40. Фотозйомку здійснювали цифровим апаратом С200о ZOOM Olympus Dp-Soft.

Результати та їх обговорення

Ендометріоми в нашому спостереженні у 23 (76,67 %) випадках мали у своїй структурі ендометріоїдний епітелій та цитогенну строму (рис. 1).

У 7 (23,33 %) жінок в ендометріомах унаслідок десквамації та некрозу епітеліальне вистелення було відсутнє, але був збережений перифокальний шар цитогенної строми. Ендометріоїдний епітелій мав, як правило, один шар і поліморфні властивості — варіював від сплощеного до високого циліндричного. У деяких випадках виявлялася світлоклітинна метаплазія ендометріоїдного епітелію з появою вислизаючих клітин. Інколи спостерігалася стромальна метаплазія з формуванням гладком’язової тканини навколо ендометріом (рис. 2). За наявність циклічних змін у більшості ендометріом свідчили ознаки свіжого або старого крововиливу, поява макрофагів, які вміщували гемосидерин, гемофусцин (сидерофаги) (рис. 3), а також децидуоподібні зміни в цитогенній стромі (рис. 2).

У більшості випадків навколо ендометріом унаслідок періодичних менструальних змін спостерігалася вторинна запальна реакція, що супроводжувалася появою клітинного інфільтрату з наявністю макрофагів, нейтрофільних гранулоцитів, лімфоцитів і плазмоцитів. У макрофагах спостерігалася висока активність пероксидази (рис. 4), естерази (рис. 5) і кислої фосфатази (рис. 6). Циклічні зміни епітелію ендометріом, а також довге існування з тиском вмісту кістом на епітеліальне вистелення в деяких випадках, як вище вказувалося, приводили до повної або часткової атрофії останнього. У деяких ендометріомах циклічні зміни ендометріоїдного епітелію та цитогенної строми були відсутні, уміст таких кістом був серозним.

Ступінь розвитку цитогенної строми значно варіював у різних ендометріомах — від широкої до вузенької перифокальної смужки. Інколи цитогенна строма була частково відсутня.

В ендометріомах зі збереженим епітеліальним вистеленням, особливо з наявністю високого циліндричного епітелію, спостерігалася велика кількість капілярів із високою активністю лужної фосфатази безпосередньо під епітеліальним вистеленням (рис. 7), що підтверджує інтенсифікацію ангіогенезу при цій патології. Нейтральні глікопротеїни, у тому числі глікоген, виявлялися у просвіті деяких ендометріом, в апікальних і базальних відділах ендометріоїдного епітелію (рис. 8). Сульфатовані і несульфатовані кислі глікопротеїни були відсутні або спостерігалися у вигляді слідів в ендометріоїдному епітелії і в стромі.

Лектиногістохімічні дослідження ендометріом показали характерну специфічність зв’язування лектинів. У кістомах зі збереженим епітеліальним вистеленням в апікальному краї та цитоплазмі епітеліальних клітин відмічалося помірна до високої експресія рецепторів LAL (рис. 9), помірна — HPA (рис. 10). Також відмічалася незначна експресія рецепторів SNA, WGA, LCA у вигляді слідів в апікальному краї епітеліальних клітин.

Появу рецепторів HPA у клітинах ендометріом можна пояснити порушенням процесів кінцевого глікозилювання вуглеводвміщуючих біополімерів —відсутністю маскування термінальних залишків D-галактози сіаловою кислотою. Відмічені порушення кінцевого глікозилювання рецепторів лектинів в ендометріомах — це прояв різко зниженої загальної здатності клітин ендометріом продукувати глікопротеїни та гліколіпіди з повністю синтезованим олігосахаридним ланцюжком.

Мозаїчність експресії рецепторів лектинів можна пояснити утворенням локальних згущень рецепторів в окремих ділянках плазмолеми внаслідок змін молекулярно-просторової структури глікокон’югат поверхні плазмолеми ендометріодних клітин і ростом мобільності мембранних рецепторів лектинів, тобто кепінг-феноменом. Сукупність перерахованого складу та властивостей поверхневих глікокон’югат обумовлює зниження контактного гальмування проліферації — провідної ознаки пухлинних клітин. У клітинній адгезії важливу роль відіграють також фуколіганди мембранних глікокон’югат. В нашому дослідженні ендометріоми мали високий або помірний уміст рецепторів фуколектину LAL, що свідчить за наявність пухлинних властивостей у цих доброякісних кістозних утвореннях яєчників.

Про високу проліферативну активність свідчила наявність в 11 (36,67 %) випадках в ендометріомах як в епітелії, так і в цитогенній стромі від помірного до високого вмісту PCNA-реактивних клітин (рис. 11).

Висновки

Ендометріоми характеризуються зниженням клітинної диференціації, змінами молекулярно-просторової структури глікокон’югат поверхні плазмолеми епітеліальних клітин і зростанням рухливості мембранних рецепторів лектинів, що веде до різкого зниження контактного гальмування проліферації. Гіперсіалізація клітинних поверхонь і зниження міцності поверхневих глікокон’югат в ендометріомах сприяє запобіганню елімінації їх клітинами імунної системи. Підвищена проліферація спостерігається в епітелії та в цитогенній стромі 36,67 % ендометріом, про що свідчить їх позитивна PCNA-реактивність.