Журнал «Актуальная инфектология» 1 (2) 2014

Статья опубликована на с. 21-25

Введение

В последние годы открытие цитокинов и изучение их роли в патогенезе широкого круга заболеваний определили приоритеты их исследования при различной патологии, в том числе при инфекционных заболеваниях. В клинической практике исследование цитокинового статуса позволяет оценить характер течения процесса и прогнозировать исход заболевания при многих инфекциях, объективно оценить эффективность терапии, особенно в случаях применения иммуномодулирующих и иммунокорригирующих средств. Цитокины также отражают индивидуальную первичную реакцию на этиотропный агент [2, 3, 5].

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма, они вовлечены фактически в каждое звено иммунитета [4, 5, 7]. Для цитокинов характерен сложный сетевой характер функционирования, при котором продукция одного из них влияет на образование или проявление активности ряда других. В связи с этими особенностями биосинтеза и регуляции цитокинов они не всегда определяются в циркулирующей крови.

Диагностическая значимость оценки уровня цитокинов заключается в констатации самого факта его повышения или понижения у данного больного с конкретным заболеванием, причем для оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания целесообразно определять концентрацию как про-, так и противовоспалительных цитокинов в динамике развития патологии.

Кроме исследования содержания цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях (слюна, моча, бронхоальвеолярная жидкость, конденсат выдыхаемого воздуха, жидкость пародонтального кармана, слезная и стекловидная жидкость, синовиальная жидкость и др.), дополнительную информацию получают при изучении способности клеток к продукции цитокинов.

Среди воспалительных цитокинов важнейшее значение имеют фактор некроза опухоли альфа (ФНО-a), интерлейкин-1 (ИЛ-1), -6, -8 и ИЛ-12, которым «противостоят» противовоспалительные цитокины — ИЛ-4, -10, -11, -13. Лекарственные средства, направленные на подавление провоспалительных цитокинов, теоретически должны восстанавливать баланс между про- и противовоспалительными цитокинами [7, 8].

К настоящему времени накоплено достаточно фактов, свидетельствующих о наличии тесного взаимодействия между уровнем содержания цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях и клиническими характеристиками инфекционного процесса. В связи с этим постоянно расширяется диапазон инфекционной патологии, при котором изучается уровень и динамика цитокинов методом иммуноферментного анализа (ИФА) или биотестов [1, 4, 6]. Исследование цитокинового статуса позволит определить характер течения инфекционного процесса, прогнозировать исход заболевания и оценить эффективность терапии.

На кафедре инфекционных болезней ВГМА им. Н.Н. Бурденко проведены исследования по изучению цитокинового статуса и динамики его показателей при ряде инфекционных заболеваний.

Цель исследования: изучение динамики показателей цитокинового профиля в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов у больных хроническим гепатитом В (ХГВ), хроническим гепатитом С (ХГС); исследование местного цитокинового статуса носоглоточного секрета и слюны у пациентов с гриппом; анализ уровня цитокинов в буллезном экссудате у больных рецидивирующей рожей.

Материалы и методы

В исследование включены 268 человек, которые были разделены на четыре группы. Первую группу (17 чел.) составили пациенты с диагнозом «хронический вирусный гепатит В средней тяжести» — 12 мужчин и 5 женщин в возрасте от 25 до 63 лет.

Вторую группу (25 чел.) — пациенты с диагнозом «хронический вирусный гепатит С средней тяжести»: 18 мужчин и 7 женщин в возрасте от 19 до 58 лет.

В третью группу включены 132 человека — 89 мужчин и 43 женщины с диагнозом «грипп А (H1N1) swl», возраст обследуемых варьировал от 18 до 65 лет.

В четвертую группу вошли 94 пациента в возрасте от 48 до 64 лет (59 женщин и 35 мужчин) с диагнозом «рецидивирующая рожа, эритематозно-буллезная форма, среднетяжелое течение».

Контрольную группу составили 89 пациентов (60 женщин и 29 мужчин).

Пациентам первой группы с диагнозом ХВГВ проводилось лечение телбивудином (себиво) 600 мг в сутки в течение 60 недель. До момента обследования больные не получали противовирусной терапии.

Во второй группе пациентов с диагнозом ХВГС средней тяжести проводили общепринятую базисную терапию, на фоне которой больные получали пегасис в сочетании с ребетолом (рибавирин) в терапевтических дозах в зависимости от массы тела в течение 12 недель (3 месяцев).

Всем больным проводилось исследование цитокинового профиля на системном (в сыворотке крови) и локальном (в супернатантах гепатобиоптатов) уровнях. С помощью ИФА определяли уровень провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-a, ИЛ-2, и противовоспалительных — ИЛ-10, ИЛ-4. Для определения уровня цитокинов на локальном уровне использовались биоптаты, полученные после проведения пункционной биопсии печени.

Третья группа больных, пациенты с диагнозом «грипп А (H1N1) swl», получали новую схему противовирусной терапии (Н1N1) — комбинацию противовирусных средств — ингавирин внутрь по 90 мг (1 капсула) 1 раз в день (курс лечения — 5 дней) и эргоферон (таблетки для рассасывания). Эргоферон, включенный в комплексную схему, назначали по 2 таблетки 4 раза в день (в первый день), со второго по пятый дни — по 1 таблетке 3 раза в день. Для характеристики местного цитокинового статуса количественно определяли в слюне и носоглоточном секрете ФНО-a, интерферон-y (ИНФ-y ), ИНФ-a, ИЛ-2 и ИЛ-10 методом ИФА.

Четвертая группа наблюдаемых пациентов с рецидивирующей рожей эритематозно-буллезной формы среднетяжелого течения была разделена на две подгруппы в зависимости от варианта проводимой терапии. Пациенты первой подгруппы (56 чел.) на фоне традиционного лечения получали озонированный физиологический раствор ежедневно в течение 5 дней в сочетании с низкоинтенсивной лазеротерапией воспалительного очага, магистрального сосудистого пучка и регионарных лимфатических узлов один раз в сутки, курс — 10 процедур.

Больным второй подгруппы — 38 человек — в дополнение к традиционной схеме назначалась внутривенная озонотерапия (инфузия озонированного физиологического раствора в течение 5 дней) в сочетании с иммуномодулятором суперлимф (ежедневные однократные аппликации на эрозивную поверхность вскрытой буллы в течение 2–3 дней).

Пациенты контрольной группы получали только традиционную терапию.

Всем пациентам с диагнозом «рецидивирующая рожа, эритематозно–буллезная форма» проводилось определение уровня цитокинов (ФНО-a, ИЛ-1b, ИЛ-10) в буллезном экссудате до начала лечения и на фоне проводимой терапии. Концентрация цитокинов (ФНО-a, ИЛ-1-a, ИЛ-10) в содержимом булл определялась методом ИФА.

При анализе полученных результатов использовались описательные методы математической статистики с применением пакета программ Microsoft Excel 2010. В процессе обработки полученных результатов применялся также метод корреляционного анализа с выявлением прямых достоверных корреляционных связей и определения коэффициента корреляции (К). Достоверность различий оценивалась методами непараметрической статистики, критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение результатов

Динамика показателей цитокинового профиля в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов у больных ХГВ была следующей (рис. 1).

Значения цитокинов ФНО-a, ИЛ-10 и ИЛ-4 в сыворотке крови больных после 3 месяцев проведенного лечения снизились в 3,3–4,3 раза (в среднем в 3,8 раза), ИЛ-2 — повысились в 1,9–2,2 раза от исходного уровня (в среднем в 2,05 раза). Через 6 месяцев противовирусной терапии уровень данных показателей улучшился в 3,9–4,7 (в среднем в 4,3) и 2,0–2,7 раза (в среднем в 2,45 раза) соответственно. Через 9 месяцев терапии исследуемые показатели имели нормальные значения у 82,4 % больных. Уровень ФНО-a, ИЛ-10 и ИЛ-4 в супернатантах гепатобиоптатов после проведенного курса противовирусной терапии снизился в 2,8–3,7 раза от исходных значений (в среднем в 6,5 раза), напротив, концентрация ИЛ-2 повысилась в 2,6–3,8 раза (в среднем в 3,2 раза). Что касается базисной терапии, то уровень цитокинового профиля претерпевал положительные изменения только после 9 месяцев лечения.

Таким образом, дополнительным методом оценки эффективности противовирусной терапии больных ХГВ могут быть показатели, отражающие дисбаланс цитокинового профиля в сыворотке крови и биоптатах печени.

При изучении показателей цитокинового профиля в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов у больных ХГС на фоне проводимой противовирусной терапии получены следующие данные (рис. 2). Содержание цитокинов ФНО-a, ИЛ-10 и ИЛ-4 в сыворотке крови больных после проведенного лечения снизилось в 2,5–4 раза (в среднем в 3,25 раза), ИЛ-2 повысился в 1,5–2 раза от исходного уровня (в среднем в 1,75). Уровень ФНО-a, ИЛ-10 и ИЛ-4 в супернатантах гепатобиоптатов снизился в 3,5–4,5 раза от исходных значений (в среднем в 4 раза), а концентрация ИЛ-2 повысилась в 1,5–2 раза (в среднем в 1,75 раза). Что касается базисной терапии, то уровень цитокинового профиля претерпевал такие же изменения только после 6 месяцев лечения.

Проведенные исследования демонстрируют, что дополнительным критерием эффективности противовирусной терапии больных ХГС является динамика уровней ФНО-a, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-2 в сыворотке крови и гепатобиоптах печени.

При изучении цитокинового статуса носоглоточного секрета и слюны у пациентов с гриппом были установлены следующие показатели (табл. 1).

В дебюте заболевания отмечена активация местных провоспалительных процессов в слизистой полости рта и носа, что демонстрируют высокие уровни ИЛ-2 в слюне (1047,83 ± 19,24 пг/мл) и носоглоточном секрете (1360,45 ± 25,66 пг/мл). В сыворотке крови при этом отмечается уровень провоспалительного ИЛ-2 370,40 ± 21,14 пг/мл, что в 6,5 раза меньше по сравнению с концентрацией в секретах. Прямую корреляционную связь имеют с концентрацией противовоспалительного ИЛ-10 в слюне и крови ИЛ-2 и ИНФ-a, т.е. локальное возрастание концентраций агрессивных прововоспалительных факторов (ИЛ-2 и ИНФ-a) при гриппе сопровождается системным увеличением противовоспалительных агентов. Также получена корреляция между содержанием ИЛ-10 и ИНФ-a в сыворотке крови и слюнной жидкости. Статистически значимые различия уровня ИНФ-a в слюне и носоглоточном секрете не выявлены. Автономный иммунный ответ показал корригирующее влияние этиотропной терапии.

Таким образом, учет динамики показателей про- и противовоспалительных профилей в слюне больных гриппом дает возможность характеризовать реакцию иммунной системы при данной патологии, прогнозировать течение заболевания, проводить адресную коррекцию лечения. Выбор слюны в качестве материала для исследования отличается неинвазивностью и простотой ее получения.

Результаты изучения динамики показателей цитокинового профиля буллезного экссудата у пациентов с рецидивирующей рожей на фоне лазеро- и озонотерапии были следующими (рис. 3).

На фоне традиционной терапии наблюдалось незначительное статистически недостоверное снижение исходного уровня концентрации провоспалительных цитокинов: ФНО-a — с 32,17 ± 3,19 пг/мл до 23,78 ± 2,07 пг/мл, ИЛ–-1b — с 129,48 ± 13,64 пг/мл до 109,56 ± 12,34 пг/мл и статистически недостоверное повышение ИЛ–10 с 77,13 ± 16,37 пг/мл до 98,32 ± 16,31 пг/мл (р < 0,05).

На фоне комбинированной терапии (озон + лазер) наблюдалось достоверное снижение концентрации провоспалительных цитокинов: ФНО-a — с 32,64 ± 4,19 пг/мл до 10,51 ± 1,29 пг/мл (р < 0,05), ИЛ-1b — с 127,83 ± 12,71 пг/мл до 57,37 ± 9,67 пг/мл (р < 0,05) и достоверное повышение ИЛ-10 с 82,78 ± 15,43 пг/мл до 219,12 ± 12,14 пг/мл (р < 0,05).

В ходе проведенных исследований у больных с буллезными формами рожи впервые определена концентрация ФНО-a, ИЛ-1b и ИЛ-10 в содержимом булл. Выявлено повышение уровня провоспалительных (ФНО-a , ИЛ-1b) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов, что имеет прогностическое значение при оценке течения болезни и эффективности проводимой терапии.

При анализе уровней про- и противовоспалительных цитокинов в буллезном экссудате у пациентов с рецидивирующей буллезной рожей на фоне системной озонотерапии и применения иммуномодулятора суперлимф были получены следующие данные.

Впервые изучен количественный уровень провоспалительных (ИЛ-1b-, ФНО-a) цитокинов и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокина в буллезном экссудате. Показатели, иллюстрирующие влияние комбинации «озонотерапия + суперлимф» на цитокиновый спектр экссудата булл, в сравнении с традиционной терапией следующие.

На фоне комбинированной терапии с применением озона и суперлимфа отмечается более выраженная коррекция уровней изучаемых цитокинов по сравнению с традиционным лечением. Так, количество провоспалительных цитокинов значительно снизилось: ФНО-a — уменьшилось в 2,5 раза, ИЛ-1b — в 4,5 раза. Противовоспалительный ИЛ-10 возрос в 2,9 раза по сравнению с традиционным лечением. У пациентов, которым проводилась традиционная терапия, содержание исследуемых цитокинов изменялось статистически значимо в позитивную сторону, однако количество ФНО-a, ИЛ-1b, ИЛ-10 в буллах на фоне комбинированного лечения статистически достоверно (р < 0,05) более значимо отличается от уровня данных цитокинов на фоне традиционного лечения. Это свидетельствует о полноценной коррекции имеющегося дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов в буллах на фоне озонотерапии в сочетании с суперлимфом. Восстановление нарушенного баланса изучаемых цитокинов ведет к адекватной продукции ФНО-a, ИЛ-1b, ИЛ-10, а значит, к быстрому ослаблению и стойкому купированию воспалительного процесса.

Таким образом, впервые в экссудате булл определен уровень ФНО-a, ИЛ-1b, ИЛ-10 — до начала терапии выявлено повышение провоспалительных (ФНО-a, ИЛ-1b) и снижение противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов.

Установлено, что динамика цитокинов в содержимом булл — снижение уровня ФНО-a, ИЛ-1b и увеличение уровня ИЛ-1b — зависит от варианта проводимой терапии. Применение внутривенной озонотерапии в сочетании с суперлимфом более эффективно устраняет гиперпродукцию провоспалительных цитокинов и способствует увеличению противовоспалительного цитокина в буллезном экссудате.

Кафедрой инфекционных болезней Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко получены патенты: изобретение № 2007139186 (042892) от 22.10.2007 г. «Способ оценки эффективности коррекции воспалительного процесса на фоне лечения больных с буллезными формами рожи»; изобретение № 2007123220 (025284) от 20.06.2007 г. «Способ определения цитокинов в буллезном содержимом».

Выводы

В ходе проведенных исследований на кафедре инфекционных болезней Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко было установлено следующее:

1. Практический аспект оценки цитокинового профиля в гепатобиоптатах и сыворотке крови у больных ХГС и ХГВ заключается в возможности предсказать неэффективность той или иной лечебной схемы, что позволит врачу провести коррекцию терапии.

2. У больных гриппом цитокиновый статус слюны (ИЛ-2 — 1047,83 ± 19,24 пг/мл) является одним из прогностических критериев течения гриппа, а также дает возможность характеризовать реакцию иммунной системы при данной патологии и проводить адресную коррекцию лечения.

3. У пациентов с рецидивирующей буллезной формой рожи динамика цитокинов в содержимом булл зависит от варианта лечения — при применении комбинированной терапии отмечается снижение уровня ФНО-a в 2,5 раза, ИЛ-1b — в 4,5 раза и увеличение уровня ИЛ-10 в 2,9 раза. Уровень цитокинов в буллезном экссудате целесообразно изучать у пациентов с рецидивирующей буллезной формой рожи с целью подбора оптимальной лечебной схемы и избегания необоснованной «перегрузки» лекарственными препаратами.

Таким образом, изучение показателей цитокинового профиля в различных биологических субстратах улучшает диагностику заболевания, а также позволяет прогнозировать течение болезни. Целесообразно оценивать динамику показателей цитокинового профиля с целью определения эффективности проводимого лечения и снижая риска терапевтических неудач.