Газета «Новости медицины и фармации» Неврология и психиатрия (277) 2009 (тематический номер)

Снижение доставки кислорода к нервной клетке в условиях острой ишемии приводит к ряду регуляторных функционально-метаболических изменений в митохондриях, среди которых нарушения состояния митохондриальных ферментных комплексов (МФК) играют ведущую роль и которые приводят к подавлению аэробного синтеза энергии. Общая ответная реакция организма на острую кислородную недостаточность характеризуется активацией срочных регуляторных компенсаторных механизмов. В нейрональной клетке включаются каскадные механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции, ответственные за экспрессию генов и формирование адаптивных признаков. Такая активация проявляется уже через 2–5 минут кислородного голодания и протекает на фоне снижения дыхания, связанного с подавлением МФК-1. Подтверждением вовлечения в адаптивные процессы внутриклеточных сигнальных систем, необходимых для формирования геномзависимых адаптивных реакций, являются активация протеинкиназ — конечных звеньев этих систем, открытие мито-К_АТФ-канала, усиление связанного с ним АТФ-зависимого транспорта К⁺, повышенная генерация H₂O₂.

На этом этапе приспособительных реакций ключевая роль отводится семействам так называемых ранних генов, продукты которых регулируют экспрессию генов позднего действия. На сегодняшний день установлено, что в мозге к таким генам относятся NGFI-A, c-jun, junB, c-fos, играющие важную роль в процессах нейрональной пластичности, обучения, выживаемости/гибели нейронов. В том случае, когда прекондиционирование оказывало защитное действие и корригировало нарушения, вызванные тяжелым гипоксическим воздействием в чувствительных к гипоксии структурах мозга, наблюдалось повышение экспрессии мРНк всех этих генов, так же как и мРНК генов митохондриальных антиоксидантов [63–66].

Более длительное пребывание в условиях сниженного содержания кислорода сопровождается переходом на новый уровень регуляции кислородного гомеостаза, который характеризуется экономизацией энергетического обмена (изменением кинетических свойств ферментов окислительного метаболизма, которому сопутствует увеличение эффективности окислительного фосфорилирования, появлением новой популяции мелких митохондрий с набором ферментов, позволяющих им работать в этом новом режиме). Кроме того, в данных условиях адаптация к гипоксии на клеточном уровне тесно связана с транскрипционной экспрессией индуцируемых гипоксией генов позднего действия, которые участвуют в регуляции множественных клеточных и системных функций и необходимы для формирования адаптивных признаков. Известно, что при низких концентрациях кислорода этот процесс контролируется прежде всего специфическим транскрипционным фактором, индуцируемым при гипоксии во всех тканях (HIF-1). Этот фактор, открытый в начале 90-х годов, функционирует как главный регулятор кислородного гомеостаза и является механизмом, с помощью которого организм, отвечая на тканевую гипоксию, контролирует экспрессию белков, ответственных за механизм доставки кислорода в клетку, т.е. регулирует адаптивные ответы клетки на изменения оксигенации тканей [67].

В настоящее время для него идентифицировано более 60 прямых генов-мишеней. Все они способствуют улучшению доставки кислорода (эритропоэза, ангиогенеза), метаболической адаптации (транспорту глюкозы, усилению гликолитической продукции АТФ, ионному транспорту) и клеточной пролиферации. Продукты регулируемых HIF-1 действуют на разных функциональных уровнях. Конечным результатом такой активации является увеличение поступления O₂ в клетку.

Идентификация и клонирование HIF-1 позволили установить, что он представляет собой гетеродимерный redox-чувствительный белок, состоящий из двух субъединиц: индуцибельно экспрессируемой кислородочувствительной субъединицы HIF-1α и конститутивно экспрессируемой субъединицы HIF-1β (транслокатор арилгидрокарбонового ядерного рецептора — aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator — ARNT). Гетеродимеризуясь с арилкарбоновым рецептором (AHR), он образует функциональный диоксиновый рецептор. Известны и другие белки семейства HIF-1α: HIF-2α, HIF-3α. Все они принадлежат к семейству основных белков, содержащих в аминокислотной концевой части каждой субъединицы базисный домен «спираль — петля — спираль» (basic helix-loop-helix — bHLH), характерный для самых различных транскрипционных факторов и необходимый для димеризации и связывания ДНК [68].

HIF-1α состоит из 826 аминокислотных остатков (120 kD) и содержит два транскрипционных домена в C-терминальном конце. В нормоксических условиях его синтез происходит с невысокой скоростью и его содержание минимально, так как он подвергается быстрой убиквитинации и деградации протеосомами. Этот процесс зависит от взаимодействия имеющегося в первичной структуре HIF-1α и специфичного для него кислородозависимого домена деградации (ODDD — oxygen dependant domen degradation) с широко распространенным в тканях белком von Hippel Lindau (VHL) — супрессором опухолевого роста, который действует как протеинлигаза.

Молекулярной основой для такой регуляции является O₂-зависимое гидроксилирование двух его пролиновых остатков P402 и P564, входящих в структуру HIF-1α, одним из трех ферментов, известных под общим названием «белки пролилгидроксилазного домена (PHD)», или «HIF-1α-пролилигидроксилазы», что необходимо для связывания HIF-1α с белком VHL. Обязательными компонентами процесса являются также α-кетоглутарат, витамин C и железо. Наряду с этим происходит гидроксилирование остатка аспарагина в C-терминальном трансактивационном домене (C-TAD), что приводит к подавлению транскрипционной активности HIF-1α. После гидроксилирования остатков пролина в ODDD и остатка аспарагина происходит связывание HIF-1α с белком VHL, которое делает доступной эту субъединицу протеосомной деградации.

В условиях резкого дефицита кислорода кислородозависимый процесс гидроксилирования пролиловых остатков, характерный для нормоксии, подавляется. В силу этого VHL не может связаться с HIF-1α, его деградация протеосомами ограничивается, что делает возможным его аккумуляцию. В отличие от этого p300 и CBP могут связываться с HIF-1α, так как этот процесс не зависит от аспарагинилгидроксилирования. Это обеспечивает активацию HIF-1α, его транслокацию в ядро, димеризацию с HIF-1β, приводящую к конформационным изменениям, образованию транскрипционного активного комплекса (HRE), запускающего активацию широкого спектра HIF-1-зависимых генов-мишеней и синтез защитных адаптивных белков в ответ на гипоксию [69–72].

Вышеприведенные механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции происходят в клетке при ее адаптации к гипоксии. В случае, когда наступает дезадаптация, в клетке накапливается значительная концентрация АФК, активизируются процессы ее апоптической гибели.

В последнее время активация нейроапоптоза, по мнению многих исследователей, является первопричиной развития стойких нарушений когнитивно-мнестических функций ЦНС. Нейроапоптоз развивается как каскадный процесс, который сопровождается  активацией (индукцией образования) специфических про- или антиапоптических белков, а также особых протеолитических ферментов — каспаз. Среди факторов запуска апоптоза следует отметить образование активных форм кислорода в процессе «извращенного» окислительного метаболизма в клетке. Существуют убедительные доказательства того, что центральная роль в продукции АФК и последующем развитии апоптоза и некроза принадлежит митохондриям, изменению проницаемости их мембран в результате формирования специфического комплекса митохондриальных пор и инициированию митоптоза [73, 74]. Первичным источником АФК оказываются митохондрии, которые играют ключевую роль в энергетическом обеспечении клетки. АФК, особенно супероксид, образуются в условиях ишемии и гипоксии в так называемых паразитарных реакциях в начальном участке дыхательной цепи митохондрий (СoQH₂-NAD⁺) при участии NADH-СoQH₂-редуктазы, активность которой повышается при блокаде цитохром-С-зависимого рецептора на внешней поверхности мембраны митохондрии на фоне повышения восстановленных флавинов. Кроме супероксида, ключевая роль в развитии митохондриальных нарушений и апоптоза принадлежит NO и его более агрессивной форме — пероксинитриту. Митохондрия нейронов является важным источником NO. Показано наличие конститутивной формы NOS, локализованной во внутренней мембране, и производство NO в митохондриях нейронов гиппокампа. Митохондриальная NOS при субоптимальных концентрациях L-аргинина способна продуцировать супероксид. Митохондриальная NOS значительно активируется в ответ на развитие глутаматной эк­сайтотоксичности и поглощение митохондриями кальция. Кроме того, в активации митохондриальной NOS определенная роль принадлежит IL-1β и TNF-α. В результате образуется пероксинитрит, способствующий открытию гигантской поры митохондрий. Пероксинитрит также нитрозилирует цитохром С в митохондриях, что приводит к изменению его функций, в частности, он становится неспособен поддерживать перенос электронов в дыхательной цепи и не восстанавливается аскорбатом. Поскольку одновременно происходит выход цитохрома С (в том числе и нитрованного) в цитоплазму, то можно предполагать участие такого процесса нитрозилирования и в каких-то сигнальных процессах [75]. Пероксинитрит нитрозилирует гуанин, что приводит к разрыву цепочек ДНК и к мутациям или запуску процессов апоптоза. Избыток NO ингибирует ферменты, ответственные за репарацию ДНК, показано действие на алкилтрансферазу, формамидопиримидин-ДНК-гликозилазу и лигазу. NO активирует PARP и ADP-рибозилирование, особенно на фоне дефицита АТФ и накопления восстановленных пиридиннуклеотидов. NO позитивно влияет на синтез белка р53, который индуцирует экспрессию Bax, Fas, p53AIP (apoptosis inducing protein) и других апоптогенных белков, а также перемещается в митохондрию при апоптозе, что может быть одной из причин выработки АФК и снижения трансмембранного потенциала на внутренней мембране. Ныне существует обобщенное понятие «митохондриальная дисфункция». Это типовой патологический процесс, не имеющий этиологической и нозологической специфичности. Развитие митохондриальной дисфункции приводит к нарушению обратного захвата медиаторов (катехоламинов, дофамина, серотонина); нарушению ионного транспорта, генерации и проведения импульса, а также синтеза белка de novo; нарушению процессов трансляции и транскрипции; активизируются «паразитарные» энергопродуцирующие реакции, что приводит к существенной убыли энергетических запасов нейрональной клетки. Кроме того, под действием гидроксил-радикала происходит открытие митохондриальных пор с экспрессией и выходом в цитозоль проапоптических белков. Открытие пор происходит за счет окисления тиоловых групп цистеинзависимого участка белка внутренней мембраны митохондрий (АТФ/АДФ-антипортер), что превращает его в проницаемый неспецифический канал-пору. Открытие пор превращает митохондрии из «электростанций» в «топку» субстратов окисления без образования АТФ. В точных биохимических исследованиях было установлено, что нарушение кислородного режима тканей, гиперпродукция эксайтотоксичных аминокислот, снижение «нормальной» аккумуляции Са⁺⁺ митохондриями, повреждение мембраны митохондрий АФК усиливает открытие пор и высвобождение апоптогенных белков из поврежденных митохондрий [76–79]. В этом контексте существенна роль одного из нейротрофических факторов — фактора некроза опухоли (TNF-α), с которым связаны открытие пор в митохондриях, последующее нарушение их мембран и развитие митоптоза. Митохондриальная пора представляет собой канал, проходящий через обе митохондриальные мембраны и состоящий из трех белков: транслокатора адениновых нуклеотидов, потенциалзависимого анионного канала (порина) и бензодиазепинового рецептора. Когда этот комплекс связывается с Са⁺⁺, через мембранную пору могут проходить вещества с небольшой молекулярной массой. Это приводит к снижению мембранного потенциала и набуханию матрикса, целостность внешней мембраны неизбежно нарушается, и из межмембранного пространства в цитоплазму выходят белки апоптоза. Их несколько: фактор, индуцирующий апоптоз (APOptosis-inducing factor — AIF), вторичный митохондриальный активатор каспаз (second mitochondria-derived activator of caspases — Smac) и некоторые прокаспазы. Индуцирующий фактор направляется прямо в ядро, где вызывает деградацию ДНК. Наряду со специфически апоптозными белками из митохондрии через открытую пору выходит цитохром С, который в норме служит конечным звеном электронно-транспортной цепи. В цитоплазме этот белок связывается с белком Apaf-1 (APOptotic protease activating factor-1 — активирующий протеазу фактор-1) и формирует апоптосомный комплекс. Он с помощью Smac и еще одного фактора (Omi/HtrA2) активирует прокаспазу-9, та, став каспазой-9, превращает два других профермента в каспазу-3 и -7; а они уже расщепляют структурные белки, приводя к появлению биохимических и морфологических признаков апоптоза [80–83].

В числе первых можно назвать, в частности, переход фосфатидилсерина в наружный мембранный слой и фрагментацию ДНК под действием АФК и NO. В этой мембране фосфатидилсерин обычно присутствует только во внутреннем липидном слое. Такое асимметричное распределение данного фосфолипида обусловлено действием особой транспортной ATPазы, переносящей фосфатидилсерин из внешнего липидного слоя плазматической мембраны во внутренний. Эта ATPаза либо инактивируется окисленной формой фосфатидилсерина, либо просто «не узнает» окисленный фосфолипид. Вот почему окисление фосфатидилсерина посредством АФК ведет к его появлению во внешнем слое плазматической мембраны. По-видимому, существует специальный рецептор, обнаруживающий фосфатидилсерин в наружном липидном слое. Предполагается, что этот рецептор, связав фосфатидилсерин, шлет внутрь клетки сигнал апоптоза [84].

Фосфатидилсерин играет ключевую роль в так называемом принудительном апоптозе, вызываемом определенным типом лейкоцитов. Клетка с фосфатидилсерином во внешнем слое клеточной мембраны «узнается» этими лейкоцитами, которые инициируют ее апоптоз. Один из апоптогенных механизмов, используемых лейкоцитами, состоит в том, что лейкоциты начинают выделять в межклеточное пространство вблизи клетки-мишени белки перфорин и гранзимы. Перфорин проделывает отверстия во внешней мембране клетки-мишени. Гранзимы входят в клетку и запускают в ней апоптоз.

Иной способ, используемый лейкоцитом для принуждения клетки-мишени к вхождению в апоптоз, состоит в ее бомбардировке супероксидом, образующимся снаружи лейкоцита посредством специальной трансмембранной дыхательной цепи плазматической мембраны. Эта цепь окисляет внутриклеточный NADPH, с которого электроны переносятся на флавин и далее на особый цитохром b, способный окисляться кислородом с выделением супероксида снаружи лейкоцита. Супероксид и другие образующиеся из него АФК окисляют фосфатидилсерин плазматической мембраны клетки-мишени, тем самым усиливая апоптозный сигнал, посылаемый клетке этим фосфолипидом [85, 86].

Кроме того, лейкоциты включают фактор некроза опухоли. TNF связывается с его рецептором на внешней стороне плазматической мембраны клетки-мишени, что активирует сразу несколько параллельных путей запуска апоптоза. В одном из них происходит образование активной каспазы-8 из прокаспазы-8. Каспаза-8 — протеаза, расщепляющая цитозольный белок Bid с образованием его активной формы tBid (truncated Bid). tBid меняет конформацию другого белка, Bax, вызывая образование проницаемого для белков канала во внешней мембране митохондрий, что приводит к их выходу из межмембранного пространства в цитозоль.

Разнообразие путей АФК-зависимого апоптоза иллюстрирует рис. 1. Истинная картина, по всей вероятности, еще более сложна, так как помимо TNF есть и другие внеклеточные индукторы апоптоза (цитокины), действующие каждый через свой собственный рецептор. Кроме того, существуют антиапоптозные системы, противостоящие проапоптозным системам. Среди них белки типа Bcl-2, тормозящие проапоптическую активность Bax; уже упоминавшиеся ингибиторы каспаз (IAP); белок NFkB (nuclear factor kB), индуцируемый посредством TNF. NFkB включает группу генов, среди которых есть те, которые кодируют супероксиддисмутазу и другие антиоксидантные и антиапоптозные белки [87].

Все эти сложности отражают то очевидное обстоятельство, что для клетки «решение покончить с собой» есть крайняя мера, когда исчерпаны все другие возможности предотвращения ее ошибочных действий.

Из числа морфологических признаков наиболее характерны «отшелушивание» клетки от матрикса, сморщивание мембраны, сжатие ядра и формирование пузырьков с клеточным содержимым — апоптозных телец. Выходу цитохрома С в цитоплазму способствует снижение рН при развитии лактат-ацидоза, усиление окислительной модификации митохондриальных белков и липидов. Последнюю реакцию как раз и вызывают АФК, которые неизбежно образуются в результате «паразитарных» энергетических реакций. Цитохром С может высвобождаться в ответ на повышение концентрации ионов Са⁺⁺, которое вызывает открывание поры, а также контролироваться белками семейства Bcl-2. Именно они регулируют апоптоз на уровне митохондрий. В запуске апоптоза, вызванного повреждениями ДНК, активацией онкогенов и гипоксией, принимает участие белок 53 (р53), взаимодействуя с Вах, стимулируя «рецепторы смерти» и апоптозные гены. р53 активирует модулятор суицида PUMA (p53 upregulated modulator of APOptosis), который затем связывает Bcl-2 и выводит из строя этот препятствующий апоптозу белок. Таким образом, выход цитохрома С из митохондрий уже ничем не сдерживается. Некоторые белки, связывающие ионы кальция, например ALG-2, кодируемый одноименным геном (APOptosis-linked gene-2), тоже принимают участие в развитии нейроапоптоза. Так, взаимодействием ALG-2 и белка Alix (ALG-interacting protein X, известный и как AIP1) осуществляется регуляция нейроапоптоза [88–92].

Приняв во внимание изложенное выше, можно представить себе следующий сценарий событий, призванных защитить организм от АФК, генерируемых митохондриями. Образовавшись в митохондриях, АФК вызывают открытие поры и, как следствие, — выход цитохрома С в цитозоль, что немедленно включает дополнительные антиоксидантные механизмы, а затем митоптоз. Если в митоптоз уходит лишь небольшая часть внутриклеточной популяции митохондрий, концентрации цитохрома С и других митохондриальных проапоптических белков в цитозоле не достигают значений, необходимых, чтобы активировать апоптоз. Если же все больше и больше митохондрий становятся суперпродуцентами АФК и «открывают кингстоны», эти концентрации возрастают и начинается апоптоз клетки, содержащей много дефектных митохондрий. В результате происходит очистка ткани от клеток, митохондрии которых образуют слишком много АФК [93].

Таким образом, можно говорить о митохондриальной дисфункции как о новом патобиохимическом механизме нейродегенеративных расстройств широкого спектра. В настоящий момент выделяют два вида митохондриальной дисфункции — первичную, как следствие врожденного генетического дефекта, и вторичную, возникающую под действием различных факторов: гипоксии, ишемии, оксидативного и нитрозирующего стресса, экспрессии провоспалительных цитокинов. В современной медицине все более значимое место занимает учение о полисистемных нарушениях клеточного энергообмена, так называемой митохондриальной патологии, или митохондриальной дисфункции.

Митохондриальные дисфункции — разнородная группа патологии, вызванная генетическими, биохимическими и структурно-функциональными дефектами митохондрий с нарушением клеточно-тканевого дыхания. Классификация митохондриальной дисфункции имеет свою историю. Одной из первых была схема, основанная на биохимических дефектах метаболизма. Недостаточно глубокой оказалась и систематизация по клиническим синдромам, среди них ранее выделяли:
1) синдромы установленной митохондриальной природы;
2) синдромы предположительно митохондриальной природы;
3) синдромы — следствия митохондриальной патологии.

Первое упоминание о болезни, связанной с дефектом митохондрий, относится к 1962 г.: R. Luft и соавт. описали случай заболевания, при котором имело место нарушение сопряжения дыхания и фосфорилирования в митохондриях скелетных мышц у пациента с нетиреоидным гиперметаболизмом. В последующие годы были описаны клинические, биохимические и морфологические аспекты митохондриальных энцефаломиопатий. В развитии этого направления большую роль сыграло использование модифицированной окраски по Гомори, с помощью которой удавлось выявлять в скелетных мышцах волокна с измененными митохондриями — так называемые ragged-red волокна (RRF) [94–97].

Позднее, с открытием митохондриального генома и мутаций мДНК или яДНК, удалось применить генетический принцип классификации для первичной, врожденной митохондриальной дисфункции — сначала в упрощенном виде, затем в усложненном. Ключевая область митохондриальной патологии — наследственные синдромы, в основе которых лежат мутации генов, ответственных за митохондриальные белки (синдромы Кернса — Сейра, MELAS, MERRF, Пирсона, Барта и др.). Митохондриальные дисфункции проявляются широким рядом клинических симптомов. Эти мутации способны вовлекать тРНК, рРНК или структурные гены и могут выражаться биохимически как дефекты всей электронно-транспортной цепи или как дефекты отдельных энзимов.

На протяжении 90-х годов XX столетия идентификация множества митохондриальных дефектов, обусловливающих клинически совершенно разные расстройства, ставила в тупик клиницистов в отношении диагностики гетерогенных и сложных синдромов, характеризующихся следующими признаками [98–100]:
— скелетные мышцы: низкая толерантность к физической нагрузке, гипотония, проксимальная миопатия, включающая фациальные и фарингеальные мышцы, офтальмопарез, птоз;
— сердце: нарушение сердечного ритма, гипертрофическая миокардиопатия;
— ЦНС: атрофия зрительного нерва, пигментная ретинопатия, мио­клонус, деменция, инсультоподобные эпизоды, расстройства психики;
— периферическая нервная система: аксональная невропатия, нарушение двигательной активности гастроинтестинального тракта;
— эндокринная система: диабет, гипопаратиреоидизм, нарушение экзокринной функции поджелудочной железы, низкий рост.

Поскольку первичные митохондриальные дисфункции проявляются у человека целым рядом различных симптомов, клиницисты попробовали объединить некоторые группы наиболее часто встречающихся комбинаций симптомов в синдромы.

MELAS — Mitochondrial Myopathy, Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактат-ацидоз, инсультоподобные эпизоды).

CPEO/PEO — External Ophtalmoplegia, Ophtalmoplegia plus syndrome (офтальмоплегия, связанная с поражением глазодвигательных мышц, офтальмоплегия плюс синдром).

KSS — Kearns — Sayre Syndrome — retinopathy, proximal muscle weakness, cardiac arrhythmia and ataxia (ретинопатия, слабость проксимальных мышц, аритмия, атаксия).

MERRF — Myoclonic Epilepsy associated with Ragged Red Fibres (миоклоническая эпилепсия с обнаружением RRF).

LHON — Leber Hereditary Optic Neuropathy (врожденная невропатия глазного нерва).

Leig syndrome — infantile subacute necrotizing encephalopathy (инфантильная подострая некротизирующая энцефалопатия).

NAPR — Neuropathy, Ataxia and Pigmentary Retinopathy (невропатия, атаксия и пигментная ретинопатия).

Однако класс состояний, характеризующихся митохондриальной дисфункцией, отнюдь не ограничивается этими «первичными» митохондриальными дисфункциями. Громадное количество болезней включает в себя нарушения клеточного энергообмена — вторичные митохондриальные дисфункции в качестве важных звеньев патогенеза. Среди них: интрацеребральная геморрагия, эпилептогенные судороги, локальное термическое повреждение мозга, нейродегенеративные расстройства, транзиторная церебральная ишемия, синдром хронического утомления, мигрени, кардиомиопатии, алкогольные энцефалопатии, сенильная деменция, нейроинфекции, кардиомиопатии, гликогенозы, болезни соединительной ткани, диабет, рахит, тубулопатии, панцитопения, гипопаратиреоз, печеночная недостаточность и многие другие. Особое значение изучение указанных нарушений имеет для практической медицины в связи с наличием достаточно эффективных возможностей терапевтической коррекции. Однако при этом следует принять во внимание, что спектр патологических нарушений клеточного энергообмена чрезвычайно велик (повреждения различных звеньев цикла Кребса, дыхательной цепи, бета-окисления и др.).

В итоге теперь митохондриальная патология подразделяется с учетом таких обстоятельств, как дефекты мДНК, дефекты яДНК, межгеномные дефекты, виды мутаций, их локус и характер, тип наследования или нозологическая единица. Разработка классификаций продолжается.

Из книги Беленичева И.Ф., Черния В.И.  и соавт.
«Рациональная нейропротекция»