Газета «Новости медицины и фармации» Гастроэнтерология (279) 2009 (тематический номер)

Фиброз является наиболее стереотипной реакцией печени на повреждение. В результате этого процесса происходит увеличение количества коллагеновых волокон [1], уменьшение нормально функционирующей паренхимы печени, что ведет к печеночной недостаточности и изменениям в системе ее кровоснабжения. В результате таких изменений развиваются портальная гипертензия и гипоксия, вторично приводящие к некротическим повреждениям органа, а также эндотоксемия вследствие выключения из функционирования печеночных макрофагов. Последние являются важным фильтром антигенов, которые поступают из кишечника с портальной кровью.

Количество больных, страдающих заболеваниями печени, во всем мире постоянно увеличивается. Поэтому проблемы диагностики фиброза печени и его мониторинга при антифибротическом лечении являются актуальными для современной медицины.

Ключевым моментом фиброгенеза является активация фиброгенных клеток в печени в результате воспалительно-некротических процессов. Процессы воспаления, некроза, апоптоза, а также накопления и деградации внеклеточного матрикса регулируются многочисленными ферментами, цитокинами и их ингибиторами [2].

На рис. 1 схематично представлен фиброгенез с указанием основных элементов, принимающих в нем участие. Активность фиброгенеза можно отследить при помощи:
а) цитокинов, продуцируемых поврежденными гепатоцитами, клетками желчных канальцев, эпителиоцитами синусоидов и привлеченными к месту повреждения лимфоцитами. Роль цитокинов в этом процессе — активация клеток с фиброгенерирующей активностью;
б) специфичных маркеров, указывающих на активацию клеток с фиброгенерирующей активностью;
в) веществ, составляющих внеклеточный матрикс.

Анализ существующих на данный момент диагностических мероприятий по-казывает, что все они касаются определения либо активности фиброгенеза, либо последствий фиброза. Золотым стандартом для определения выраженности фиброза остается биопсия печени, в то же время все чаще используются неинвазивные методы как более щадящие для пациентов. Их диагностическая ценность подтверждается сравнением результатов, полученных при их применении и при оценке печеночного биоптата.

Оценка процессов фиброгенеза

Для оценки биохимических показателей необходимо понимание процесса фиброгенеза. Фиброгенез запускается с помощью многочисленных сигналов и осуществляется звездчатыми ретикулоцитами (клетками Купфера), эпителиальными клетками, а также, по данным некоторых авторов, самими гепатоцитами. Результатом фиброгенеза является отложение большого количества экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) — элементов соединительной ткани — коллагена (преимущественно ІV типа), ламинина, фибронектина, протеогликанов. Одновременно синтезируется и ингибитор металлопротеиназы — фермент, который участвует в деградации коллагена. В последующем все зависит от того, прекращается ли действие повреждающего фактора (вирусов, аутоантител, токсинов и т.п.). Если фактор перестает действовать, происходит активация металлопротеиназы и деградация коллагена с восстановлением структуры печеночной ткани. Такой вариант является благоприятным. Подобные наблюдения описаны у пациентов с синдромом перегрузки железом и медью, алкоголь-индуцированным поражением печени, хроническими вирусными гепатитами, неалкогольным стеатогепатитом, аутоиммунным гепатитом [3–6]. Регрессия происходит благодаря деградации фибриллярного коллагена под воздействием специфичных ферментов — интерстициальных протеиназ (ММР-1, -8 и -13) и в результате апоптоза (после стимуляции определенными цитокинами) активированных клеток с фибробластной активностью (звездчатых ретикулоцитов).

При продолжении действия повреждающего фактора накопление ЭЦМ ведет сначала к замещению им паренхимы печени, подвергшейся коллапсу [7]. Постепенное разрастание коллагена вызывает механическое повреждение оставшихся гепатоцитов, нарушение их кровоснабжения. Следствием этих процессов является снижение функциональных свойств печени. Клиническая картина обусловлена местом скопления ЭЦМ: вокруг портальных трактов, центральных вен или желчных протоков. Фиброз, развивающийся вследствие хронической вирусной инфекции, первоначально концентрируется в пределах и вокруг портальных трактов, в то время как фиброз вследствие токсически-метаболического по-вреждения локализуется в основном в центролобулярной области. В свою очередь, локализация начального печеночного повреждения обусловливает вид клеток, участвующих в фиброгенезе. Так, при повреждениях в пределах печеночной дольки над продукцией ЭЦМ работают клетки Купфера, при локализации повреждения вокруг портальных трактов — портальные фибробласты [8].

Для различных типов печеночных клеток (гепатоцитов, купферовских клеток, эпителиальных клеток желчных протоков, тучных клеток синусоидных капилляров) идентифицированы генные маркеры, то есть метки, по наличию которых можно серологически распознать, какие именно клетки присутствуют и в каком функциональном состоянии они находятся (спокойном или активированном). Понимание этих процессов дало возможность идентифицировать ключевые аспекты фиброгенеза [9]. К сожалению, патогенез фиброза при вирусных поражениях недостаточно изучен, так как основные эксперименты для изучения фиброза проводятся на грызунах, для которых модель HCV- и HBV-инфекции еще не разработана.

Определение пролиферации клеток печени

Свой вклад в понимание процессов фиброгенеза внесли маркеры пролиферации гепатоцитов — мини-хромосомные протеины (Mcm-2), их чувствительность оказалась большей, чем у обычных маркеров деления клеток Ki-67. Знание их локализации дает возможность установить пролиферацию не только гепатоцитов, но и клеток билиарных протоков, синусоидальных эпителиоцитов и лимфоцитов, инфильтрирующих клеточную пластинку. Важно то, что пропорция гепатоцитов, экспрессирующих этот антиген, позитивно коррелирует со стадией фиброза (Р = 0,0001), то есть в дальнейшем определение этого маркера может использоваться для определения стадии фиброза [10]. К маркерам пролиферации гепатоцитов также относятся фактор роста гепатоцитов (Hepatocyte growth factor — HGF) — цитокин, стимулирующий рост гепатоцитов и рецептор к нему — c-Met. В экспериментальных иммуногистохимических исследованиях было выявлено, что высокую пролиферативную способность гепатоцитов на ранних стадиях цирроза индуцирует рост HGF и реактивная экспрессия c-Met. На поздних же стадиях содержание HGF и c-Met значительно уменьшается, что отображает повреждение регенерирующей способности клеток печени [7]. К ингибиторам пролиферации гепатоцитов относится также белок р-21, экспрессируемый гепатоцитами в ответ на оксидативный стресс. Способность к его экспрессии разная у различных индивидуумов, что отражает индивидуальный ответ на одинаковые повреждения и разную скорость прогрессирования цирроза [11].

Анализ веществ, составляющих внеклеточный матрикс

Метаболизм ЭЦМ регулируется матриксными металлопротеиназами (ММР) и их специфическими ингибиторами (ТIМР и YKL-40) [12]. Описано значение определения уровня сывороточных ММР-2 и ТIМР-1 для диагностики фиброза и цирроза печени. Показано, что определенные уровни ММР-2 и ТIМР-1 помогают с высокой чувствительностью выявлять цирроз, но не имеют достаточного значения для выявления фиброза. Предполагается, что регулярное определение этих показателей может быть использовано как индикатор прогрессирования фиброза и развития цирроза [13]. Однако эти и подобные им маркеры неспецифичны для печени и могут отражать процессы фиброза также и в других органах (поджелудочной железы, легких). Маркером фиброза печени является и уровень гиалуроновой кислоты, или, как ее еще называют, гиалуроната, в сыворотке крови. По некоторым данным этот показатель обладает высокой чувствительностью для диагностики выраженного фиброза [14]. Во-первых, это вещество входит в состав ЭЦМ, и содержание его увеличивается при деградации межклеточного вещества. Во-вторых, удаление гиалуроновой кислоты происходит через эпителиальные клетки печени с помощью рецепторзависимого механизма, и накопление гиалуроната в плазме отражает недостаточную функцию печени. Определение уровня гиалуроновой кислоты используется также для мониторирования результатов лечения в отношении фиброза при первичном билиарном циррозе [15]. Этот маркер используется и в педиатрической практике. При его уровне выше 200 мг/мл можно достоверно предположить значительный фиброз, а при уровне менее чем 50 нг/мл — отсутствие фиброза [16]. Для определения фиброза у пациентов с неалкогольной жировой дистрофией печени используется измерение уровня компонентов ЭЦМ — ламинина, коллагена IV типа и гиалурона [17, 18]. Ламинин — один из гликопротеинов, входящих в состав ЭЦМ. Диагностическая ценность метода оказалась невысокой, но авторы предлагают использовать определение уровня ламинина в качестве индикатора для отбора пациентов, нуждающихся в биопсии печени, а также предполагают, что его определение может способствовать диагностике эпителиальных опухолевых метастазов и перитонеального канцероматоза [19]. Предложены протеомные технологии, которые используют определение большого количества протеинов (несколько сотен) из одного образца крови, реакции взаимодействия между ними и активность различных ферментов. Благодаря этим исследованиям были выявлены 30 особенностей у пациентов с хроническим гепатитом В — предикторов значительного фиброза и цирроза. Предполагается, что пациенты с активным фиброгенезом имеют отличительные особенности (подобно отпечаткам пальцев), выбранные из большого количества показателей. При использовании подобных методов может быть получена детальная картина белкового гликозилирования — так называемый гликом. Но надо заметить, что сами авторы считают, что найденные изменения могут быть скорее признаками гепатоцеллюлярной регенерации, чем фиброза [20].

Анализ цитокинов, регулирующих воспалительные процессы и апоптоз

Ведутся работы по изучению экспрессии индукторов и ингибиторов апоптоза — регуляторов клеточных каспаз — белков семейства Вс1-2. Однако полученных результатов недостаточно для использования в клинической практике. До настоящего времени не обнаружены различия в степени воспаления и фиброза, которые зависели бы от локализации этих белков: в гепатоцитах, эпителиальных клетках интралобулярных желчных протоков и в лимфоидных клетках, инфильтрирующих портальные зоны и дольки. Максимальная экспрессия Bcl-xL в гепатоцитах наблюдалась при третьей степени воспаления и четвертой стадии фиброза. Экспрессия протеина Вс1-2 в клетках желчных протоков коррелировала со степенью воспаления, но не со стадией фиброза. Зависимости экспрессии Вс1-2 в лимфоидных клетках ни от степени воспаления, ни от стадии фиброза обнаружено не было [21].

Рассматривается и роль трансформирующего фактора роста (TGF-β) в печеночном фиброгенезе. У пациентов без прогрессирования фиброза уровень этого цитокина достоверно ниже, чем у пациентов с прогрессированием процесса. Вместе с тем не найдено никакой зависимости между фиброгенезом, уровнем трансаминаз и вирусной нагрузкой и проколлагеном ІІІ [22].

Оценка последствий фиброза

Диагностика фиброза производится также и по определению его последствий (рис. 2). Следствием замещения печеночной паренхимы соединительной тканью является: во-первых, уменьшение массы функционирующих клеток, что приводит к недостаточности всех функций печени (синтетической, дезинтоксикационной, гомеостатической и т.п.); во-вторых, перестройка архитектоники печени, изменение давления в синусоидах, портальных трактах, результатом чего является портальная гипертензия.

Оценка морфологических изменений

Оценка морфологических изменений осуществляется после проведения биопсии печени и до настоящего времени считается золотым стандартом, с которым сравнивается диагностическая ценность всех других методов определений фиброза. Еще более точная оценка возможна при анализе компьютерными программами изображений биоптата. Неиназивными способами оценки морфологических изменений печени служат ультразвуковое исследование, компьютерная томография и магнитно-резонансная томография. Но адекватная чувствительность и специфичность этих исследований возможна только при далеко зашедшей болезни с признаками портальной гипертензии.

Оценка изменений эластичности печени

Методы, используемые для оценки изменения эластичности печени, поданы в порядке убывания чувствительности: магнитно-резонансная эластография, ультразвуковая эластография, определение скорости кровотока в портальной системе.

Магнитно-резонансная эластография показала высокую точность и специфичность, сопоставимую с биопсией печени, а также диагностическую ценность в отношении разграничения начальных стадий фиброза и здоровой печеночной ткани [23]. Но надо отметить, что недостатком метода являются его дороговизна и недоступность этой диагностической процедуры для нашего населения.

С недавнего времени используется (более широко — за рубежом, где он доступен) метод непрямой эластографии печени с помощью аппарата FibroScan (EchoSens, Франция), основанный на ультразвуковом измерении скорости и распространении механических колебаний, искусственно создаваемых аппаратом, на ткань печени. Ограничение техники заключается в том, что сигнал проходит через ткань толщиной от 25 до 65 мм, следовательно, ультразвуковая эластография непригодна для пациентов с ожирением. Метод также не позволяет различить фиброз и стеатоз печени [24]. В связи с этим опубликованы систематический обзор и метаанализ исследований, посвященных диагностической ценности непрямой эластографии печени. В каждое из исследований входило сравнение данных, полученных с помощью этого метода, с данными золотого стандарта — биопсии печени. Анализ показал, что ценность метода в выявлении цирроза выше, чем при других стадиях фиброза печени. Вместе с тем авторы не исключают, что причиной таких результатов является небольшое количество существующих исследований с таким дизайном, а также то, что в дальнейшем, после поправки на спектр пациентов и качество биопсии, эффективность ультразвуковой эластографии в определении ранних и поздних стадий фиброза окажется сходной с биопсией печени [25]. При сочетании эластографии с фибротестом предикторная ценность этих исследований для умеренного и выраженного фиброза улучшается.

Косвенным методом измерения эластичности печени для оценки степени ее фиброза является определение скорости кровотока в портальной системе при помощи допплерографического исследования. Метод основан на возможности оценить артериальный кровоток в печени в систолу и диастолу. Так, если систолический кровоток прежде всего зависит от сердечного выброса, то диастолический во многом определяется внутриорганным сосудистым сопротивлением. Прогрессирование фиброза сопровождается ростом давления в системе воротной вены и, реактивно, увеличением сопротивления току крови по селезеночной артерии. Наиболее информативным показателем для диагностики выраженности фиброза считают пульсативный индекс селезеночной артерии [26].

Непрямым методом оценки морфологических изменений структуры печени является ультразвуковое исследование печени, селезенки, диаметров портальной и селезеночной вен. Несмотря на доступность метода, его диагностическая ценность в отношении динамики процесса невелика, а высокая специфичность наблюдается только при далеко зашедшем процессе.

Оценка фиброза по функциональной недостаточности печени

Для оценки фиброза по степени печеночной недостаточности исследовались многочисленные показатели и комбинации их, составляющие различные шкалы и индексы измерения. Так, учитываются активность трансаминаз, количество тромбоцитов, протромбиновое время [27, 28]. Во многих работах обсуждается ценность такого косвенного метода определения повреждения клетки, как уровень коэффициента АСТ/АЛТ. Отношение этих индикаторных печеночных ферментов показательны, поскольку отражают глубину поражения гепатоцита. АЛТ является цитоплазматическим ферментом и повышается прежде других при гепатоцеллюлярном повреждении. АСТ локализуется в митохондриях, и повышение его уровня происходит при более глубоких поражениях печеночной клетки. Описаны исследования диагностической ценности этого показателя при вирусных гепатитах В и С, первичном билиарном циррозе, алкогольной болезни печени, аутоиммунном гепатите. Мнения ученых о диагностической ценности этого показателя расходятся. Так, одни исследователи называют коэффициент надежным маркером фиброза и цирроза печени при хроническом гепатите С [29]. Другие предлагают использовать маркер совместно с оценкой уровня тромбоцитов, что позволяет диагностировать наличие значительного фиброза у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С [30]. Этот показатель применяют для диагностики фиброза при хроническом гепатите В [31]. Показано, что высокий коэффициент АСТ/АЛТ достоверно ассоциирован с варикозом пищевода и асцитом. И наоборот, некоторые исследования выявляют недостаточную чувствительность коэффициента АСТ/АЛТ для диагностики фиброза при первичном билиарном циррозе и хронических вирусных гепатитах [32–34].

Для скрининга пациентов с гемохроматозом предлагается определение уровня сывороточного ферритина. Установлено, что при уровне его ниже 1000 мкг/л вероятность цирроза у этой категории пациентов очень низка [35]. Для оценки функционального состояния печени используются тесты, оценивающие перфузию различных веществ через печень. Среди них: исследование этилирования лидокаина — MEGX-тест [36], дыхательные тесты с ¹³С-галактозой и ¹³С-аминопирином. В метаболизме этих веществ участвуют ферментные печеночные системы — цитохром Р450 и галактокиназа, имеющие различную локализацию (микросомы и цитоплазма гепатоцита). Обнаружено, что функция этих систем нарушается достаточно рано, и предполагается, что сочетанное использование дыхательных тестов дает информацию о наличии компенсированного цирроза печени [37]. Имея высокую чувствительность и специфичность в разграничении хронического гепатита и цирроза, вышеназванные тесты не подходят для определения начальных и умеренных степеней фиброза [36].

Комбинированные оценки функции печени, показателей воспалительной реакции и фиброгенеза

Широкое распространение в Европе и США получила оценка фиброза печени с использованием комбинации показателей острофазной воспалительной реакции печени и печеночной недостаточности (Fibrotest, BioPredictive, Франция), а именно: АЛТ, общего билирубина, α1-макроглобулина, апопротеина А1 и γ-глутамилтрансферазы. Как было показано в нескольких исследованиях, уровень этих веществ достоверно коррелировал с клинической стадией печеночного фиброза [38, 39]. Применение Fibrotest имеет следующее обоснование. α1-макроглобулин стимулирует купферовские клетки, тем самым индуцируя фиброгенез. Апопротеин А1 отражает синтетическую функцию печени и снижается по мере возрастания печеночной недостаточности параллельно с повышением общего билирубина. О степени воспаления свидетельствуют уровни АЛТ и γ-глутамилтрансферазы, причем в терминальной стадии печеночной недостаточности уровень трансаминаз снижается. Чувствительность и специфичность фибротеста повышаются по мере усугубления фиброза, на начальных же стадиях эти показатели невелики [40]. Надо отметить, что метод ограничен ложнопозитивными результатами при возрастании уровня билирубина и уменьшении уровня гаптоглобина, не связанными с печеночной недостаточностью (гемолиз, функциональные гипербилирубинемии, холестаз, не связанный с фиброзом).

Другим патентованным тестом, определяющим комбинацию воспалительных маркеров и показателей фиброгенеза, является система FIBROSpect II, учитывающая уровни гиалуроновой кислоты, тканевого ингибитора металлопротеиназы I (TIMP-I) и α2-макроглобулина. Показана высокая эффективность данного теста для определения среднетяжелого и тяжелого фиброза и относительно низкая — при начальных стадиях процесса [41]. Комбинированный тест, созданный Европейской группой по изучению фиброза печени (European Liver Fibrosis study group), включает определение множества матриксных протеинов: коллагена IV типа, коллагена VI типа, аминотерминального полипептида коллагена III типа (PIIINP) и др. Положительной особенностью этого теста является то, что, в отличие от большинства других (относительная эффективность которых была доказана на пациентах с хроническим вирусным гепатитом С), объектом изучения в этом случае были пациенты с различными заболеваниями печени [42].

Рассматривается диагностическая точность индекса АРRI (отношение АСТ к количеству тромбоцитов) для оценки выраженности фиброза [43, 44]. Так, была выявлена 100% чувствительность индекса в идентификации выраженного фиброза (при АРRI > 0,4) у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С при постоянно нормальных уровнях АЛТ при сравнении его с данными биопсии печени [45]. Нашел применение этот коэффициент при сочетании вирусного гепатита С и ВИЧ или с хронической почечной недостаточностью [46, 47]. Немного видоизмененная формула (АСТ/верхняя граница нормы)/число тромбоцитов [10⁹/л]) × 100 предлагается C.T. Wai. Нижние и верхние пороговые значения для стадий F2–F4 — соответственно 0,5 и менее и 1,5 и более [48].

Заключение

Маркеры печеночного фиброза являются альтернативой биопсии по причине их неинвазивности, простой воспроизводимости и точности в отношении выраженного фиброза и цирроза печени. Но они недостаточно информативны для определения разницы между здоровой тканью печени и начальным фиброзом, а также начальным и умеренным фиброзом. Именно такая градация внутри шкалы фиброза и востребована в данный момент для отслеживания результатов антифибротического лечения. С другой стороны, неинвазивные методы могут найти свое применение для решения вопроса о начале терапии хронических вирусных гепатитов.

В настоящее время некоторые исследователи пытаются найти ответы на вопрос: могут ли индивидуальные генетические особенности человека влиять на риск развития фиброза? Существующие многочисленные научные данные получены в результате исследований уровня «случай — контроль», большинство из них оказались невоспроизводимыми и с недостаточно надежным дизайном исследования [49]. Диагностическая ценность всех неинвазивных методов диагностики фиброза еще должна подтверждаться мультицентровыми независимыми исследованиями [50].

Используемые серологические маркеры больше показывают процессы фиброгенеза, фибринолиза и их последствия. Будущее за усовершенствованием техник видеовизуализации — так называемыми технологиями нановизуализации, которые были бы способны качественно и количественно определять и структурные изменения, и воспаление [51, 52].