Газета «Новости медицины и фармации» 10(284) 2009

Ниркова недостатність — один із найбільш небезпечних патологічних станів. Тяжкі порушення водно-електролітного й азотного обміну є основними патогенетичними факторами, що визначають високу летальність при нирковій недостатності [6, 10]. Фармакологічна корекція цих порушень залишається найважливішим завданням медицини й обумовлює необхідність пошуку нових підходів до лікування [10]. Серед консервативних методів детоксикаційної терапії помітного поширення набув метод ентеросорбції, що зумовлено його простотою, безпечністю й економічністю. Ентеросорбенти при довгостроковому прийманні здатні полегшувати навантаження на нирки при елімінації ендо- та екзотоксинів, зменшуючи прояви уремії [7]. При цьому надзвичайно важливою є відсутність негативного впливу на нирки самих медикаментозних факторів [8], зокрема ентеросорбентів.

Мета роботи — вивчити вплив ентеросорбенту Ентеросгель (паста) на структурні компоненти нирок за умов його тривалого введення в дозі, що вдвічі перевищує середню терапевтичну, а також дослідити ефективність його застосування за умов експериментальної ниркової недостатності.

Матеріали та методи

Для вивчення впливу на структурні компоненти нирок препарат Ентеросгель у лікарській формі пасти для перорального застосування попередньо розводили у воді у співвідношенні 1 : 1 до отримання однорідної суспензії і вводили щурам внутрішньошлунково в дозі 1300 мг/кг протягом 60 діб. Евтаназію тварин здійснювали шляхом декапітації під тіопенталовим наркозом. Матеріал для патоморфологічних досліджень відібрали від 5 тварин, фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну [2]. Фарбування гістологічних зрізів проводили гематоксиліном й еозином. Перегляд мікропрепаратів здійснювали за допомогою світлового мікроскопа.

Забір матеріалу для електронно-мікроскопічного дослідження компонентів нирки проводили відповідно до загальноприйнятих правил [3]. Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомі УМПТ-7, забарвлювали 1% водним розчином уранілацетату, контрастували цитратом свинцю за методом Рейнольдса та вивчали в електронному мікроскопі ПЕМ-125К.

В експерименті з вивчення ефективності Ентеросгелю за умов ниркової недостатності використано 40 білих щурів, які знаходились на стандартному раціоні віварію [4]. Тварини були розподілені на три групи: I — інтактні (n = 8); II (контрольна) — тварини з нирковою недостатністю (n = 16); III — тварини, які отримували Ентеросгель на фоні експериментальної ниркової недостатності (n = 16).

Для моделювання гострої ниркової недостатності (ГНН) щурів витримували 24 години без їжі, після чого внутрішньом’язово вводили 50% водний розчин гліцеролу в дозі 10 мл/кг маси тіла тварини [11]. У третій групі вводити Ентеросгель починали за 1 годину до застосування гліцеролу. Надалі сорбент тварини отримували щодня інтрагастрально о 9 год ранку в дозі 650 мг/кг маси тіла впродовж 14 діб, при цьому годування тварин проводилося о 12 год, що знижувало ймовірність поглинання сорбентом компонентів їжі. Усіх тварин поміщали в обмінні клітки й збирали сечу в умовах спонтанного діурезу протягом 24 год, вивчаючи функціональний стан нирок [1]. За показниками добового діурезу, швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ), реабсорбції води в ниркових канальцях розраховували відносний діурез. У пробах сечі визначали білок, креатинін, сечовину [1], обчислюючи добову екскрецію білка й креатиніну; у пробах крові визначали концентрацію білка, креатиніну, сечовини [5].

Досліди були проведені у 2 етапи. Перший етап полягав у дослідженні функціональних показників нирок на 3-тю добу після введення гліцеролу (фаза поліурії). При цьому добову сечу збирали в обмінних клітках, кров для дослідження креатиніну забирали з хвостової вени. На 2-му етапі для з’ясування еволюції патологічного процесу при гліцероловому ураженні нирок у щурів, зокрема можливості формування хронічної ниркової недостатності (ХНН), була виконана окрема серія дослідів на цій же групі тварин через 45 діб після введення їм гліцеролу. З цією метою теж збирали добову сечу, а після евтаназії тварин у їх крові визначали вміст білка, креатиніну, сечовини і молекул середньої маси (МСМ) [5, 9].

Результати і їх обговорення

Вивчення морфології паренхіми нирок при 60-добовому введенні препарату Ентеросгель показало, що кіркова й мозкова речовина добре контурують, епітелій звивистих канальців у межах норми, місцями виявляються ділянки ішемії, що може бути пов’язано з методом евтаназії. Малюнок капілярних петель достатньо добре проглядається, клітинна насиченість петель нормальна, сечовий простір у межах норми, просвіт канальців звичайний. Рівень розпушення апікальних відділів нефроцитів проксимальних часток канальців нефронів помірний, мозковий шар без особливостей. У просвіті окремих проксимальних канальців зустрічається помірна дистрофія епітелію, що, очевидно, пов’язано з методикою евтаназії.

Проведені детальні електронно-мікроскопічні дослідження структурних компонентів нефрону: ниркових тілець, проксимальних і дистальних звивистих канальців кіркової речовини нирок. Встановлено, що структури фільтраційного бар’єру не зазнали змін.

Подоцити, що складають внутрішній листок капсули тільця, тісно прилягають своїми відростками (цитотрабекулами) до капілярів судинного клубочка. Подоцити розмежовуються один від одного широкими міжклітинними просторами. Від тіл подоцитів відгалужується декілька широких довгих відростків — цитотрабекул, які, у свою чергу, дають початок багатьом дрібним структурам — цитоподіям, що контактують із гломерулярною базальною мембраною. Цитоплазма тіл та трабекул подоцитів відносно електронносвітла. Ендоплазматична сітка розвинута помірно. Кількість мітохондрій незначна, й вони середніх розмірів, мають мало крист, проте наявні окремі гіпертрофовані мітохондрії. Диктіосоми комплексу Гольджі містять окремі цистерни та вакуолі. Тіла подоцитів містять ядра овальної форми з дрібнозернистим хроматином. Цитоплазма цитоподій виглядає більш щільною, із вмістом тонких мікрофібрил. Між цитоподіями є невеликі щілини.

Базальна мембрана складається із трьох шарів: середнього — електроннощільного, зовнішнього та внутрішнього, що світліші. З протилежної сторони до такої мембрани прилягають ендотеліоцити гемокапілярів судинного клубочка, цитоплазматичні тонкі ділянки яких містять численні фенестри. Субмікроскопічні дослідження епітеліоцитів проксимального відділу нефрону показали, що на апікальній поверхні знаходиться велика кількість мікроворсинок, які відділені одна від одної вузькими щілинами й у сукупності формують щіточкову облямівку, що збільшує площу поверхні клітин.

В основі мікроворсинок плазмолема інвагінується в цитоплазму і формує численні міхурці, кавеоли, невеликі вакуолі. У цитоплазмі більшості клітин спостерігаються круглі ядра з добре контурованими ядерними мембранами й численними ядерними порами. В каріоплазмі наявні осміофільні ядерця і переважає еухроматин. Гетерохроматин утворює невеликі електронно-щільні грудки, які переважно розташовані по периферії каріоплазми.

Гранулярна ендоплазматична сітка слабо розвинена, складається з невеликої кількості помірно розширених цистерн. У цитоплазмі спостерігається помірна кількість рибосом і полісом, осміофільні круглої форми лізосоми. У базальному полюсі плазмолема клітин утворює вузькі складки, що проникають у цитоплазму. Між ними знаходяться численні мітохондрії, що мають паличкоподібну або овальну форму, помірно електронно-щільний матрикс, чіткі кристи.

Епітеліальні клітини проксимального відділу нефрону лежать на добре вираженій базальній мембрані, що тісно прилягає до кровоносних капілярів, які розміщуються між канальцями. Гемокапіляри перитубулярної кровоносної сітки, що оточує звивисті канальці, належать до вісцерального типу. Просвіти їх невеликі за розмірами, у периферичних ділянках ендотеліоцитів наявні фенестри. Середній фібрилярний шар їх базальної мембрани чітко виражений. Ендотеліальні клітини капілярів подовженої форми. Еліпсоподібні ядра містять гетерохроматинові й еухроматинові ділянки, рибосомальні гранули та відносно рівномірний перинуклеарний простір. Периферичні ділянки ендотеліоцитів фенестровані, у цитоплазмі наявні рибосоми, поодинокі мітохондрії, піноцитозні міхурці.

Субмікроскопічні дослідження епітеліоцитів дистальних канальців показали, що відмінностей структури ядра й цитоплазми від норми не відмічається. Клітини даного відділу нефрону мають електронно-світлу гіалоплазму, в апікальній частині знаходиться мало органел, у базальній — наявні глибокі складки плазмолеми з паралельно розташованими до них мітохондріями. Тільки окремі мітохондрії гіпертрофовані й мають добре розвинені кристи.

Отже, гістологічне й електронно-мікроскопічне дослідження нирок тварин, яким протягом 60 діб внутрішньошлунково через зонд вводили Ентеросгель у дозі 1300 мг/кг, показало відсутність будь-яких морфологічних змін, що можуть свідчити про токсичну дію речовини, що вивчалась.

У ході експерименту з вивчення ефективності Ентеросгелю за умов ниркової недостатності зафіксована загибель тварин: на 1-му етапі в ІІ групі загинули 2 особини, на 2-му етапі в групі ІІ — 4 особини, а в групі ІІІ — 2 особини. При вивченні добового діурезу, який досліджували в поліуричній стадії ГНН, нами встановлено підвищення цього показника порівняно з інтактними тваринами у 2,9 раза (табл. 1).

Після введення щурам із ГНН Ентеросгелю добовий діурез знизився на 16 % порівняно з тваринами контрольної групи, однак значно перевищував рівень інтактних (у 2,5 раза). Введення гліцеролу супроводжувалося вірогідним зниженням ШКФ, розрахованої за кліренсом ендогенного креатиніну (у 1,9 раза), що свідчить про глибокий ступінь ураження клубочкового апарата. Ентеросгель виявляв помірну позитивну дію на цей показник. Зафіксовано також збільшення ШКФ на 12,5 %, але цей показник вірогідно не відрізнявся від контролю.

Споживання води тваринами з експериментальною ГНН було вірогідно вищим (на 45,2 %), ніж інтактними, і становило 13,5 мл/100г за добу, що можна пояснити дегідратуючою дією гліцеролу. Введення Ентеросгелю суттєво не впливало на споживання води тваринами. Розрахований нами показник реабсорбції води в ниркових канальцях продемонстрував позитивний вплив сорбенту на цей важливий показник канальцевого апарата нирок.

На підставі даних про рівень добового діурезу і споживання води нами був розрахований відносний діурез. У тварин із ГНН цей показник зріс у 2,1 раза порівняно з інтактними. Застосування сорбенту не мало суттєвого впливу на відносний діурез.

Одним із показників, що характеризують функціональний стан нирок, є креатинін, який не реабсорбується в ниркових канальцях, тому його екскреція з сечею є показником фільтраційної здатності нирок [1]. При порушенні функції нирок вірогідно збільшується вміст креатиніну в крові. Так, після розвитку ГНН його концентрація підвищилася в 4,5 раза, а введення ураженим тваринам Ентеросгелю спричиняло зниження вмісту креатиніну на 32 % порівняно з контрольними тваринами.

Спостерігалося також збільшення виділення креатиніну з сечею уражених щурів, що може бути наслідком як значного збільшення його в крові, так і зростання добового діурезу. Після введення щурам із нирковою недостатністю Ентеросгелю спостерігалося зниження виведення креатиніну на 31 % порівняно з показниками рівня тварин контрольної групи.

Результати дослідження добового виділення білка з сечею наведені в табл. 1. Виділення білка тваринами контрольної групи збільшується в 1,3 раза, що, очевидно, може бути пов’язано з підвищенням проникності ниркового фільтру. Ентеросгель позитивно впливав на цей показник, демонструючи тенденцію до зниження підвищеного вмісту білка після розвитку ниркової недостатності.

Досліди, виконані через 45 діб після моделювання гліцеролової недостатності нирок, показали, що у щурів сформувалося хронічне порушення видільної функції нирок (табл. 2). Про це свідчили значне (майже дворазове) зниження ШКФ, гіперкреатинінемія (концентрація креатиніну перевищувала показник інтактних тварин майже в 4 рази, р < 0,01) і протеїнурія, що зберігається (добова екскреція білка перевищувала аналогічний показник інтактних тварин більше ніж у 3,3 раза, р < 0,01).

Корекція Ентеросгелем істотно впливала на основні показники функціонального стану нирок. Нами зафіксовано вірогідне збільшення ШКФ, що в 1,9 раза перевищувала аналогічний показник уражених тварин і майже наближалася до рівня інтактних. Вірогідно знижувався показник добового виділення білка з сечею і вміст креатиніну в крові, що вказує на істотне збільшення фільтраційної здатності нирок. Збільшувалася також реабсорбція води нирковими канальцями. При вивченні біохімічних показників крові (табл. 3) ми встановили істотне зниження концентрації білка в плазмі крові тварин із ХНН. В інтактних тварин цей показник становив 65,0 ± 2,5 г/л, а у тварин із нирковою недостатністю — 53,0 ± 1,85 г/л, що є в 1,2 раза нижчим.

Однією з причин зниження вмісту білка, крім підвищеної екскреції з сечею, може бути розпад білкових молекул з утворенням МСМ, що підтверджується отриманими результати досліджень та вказує на розвиток ендогенної інтоксикації в ураженому організмі.

Дослідження вмісту МСМ, зокрема фракції МСМ1, у якій переважають ланцюжкові амінокислоти, показало, що він підвищується в ураженому організмі в 1,5 раза через 45 днів від початку введення гліцеролу. Аналогічна тенденція спостерігалася і щодо фракції МСМ2 (у якій переважають ароматичні амінокислоти). Вміст її збільшився в 2 рази. Введення Ентеросгелю сприяло до зниженню вмісту МСМ обох фракцій. Для МСМ1 воно становило 26 % порівняно з ураженими тваринами, а для МСМ2 — 66 % відповідно.

Нами досліджено вміст сечовини в сироватці крові щурів з нирковою недостатністю. Виявлено, що на 45-ту добу після введення гліцеролу вміст сечовини підвищується в 2 рази, що свідчить про розвиток уремії в досліджуваний період. Введення Ентеросгелю сприяло вірогідному (р < 0,05) зниженнб цього показника, що вказує на позитивний вплив даного ентреросорбенту на азотний обмін.

Висновки

Отже, при гістологічному й електронномікроскопічному дослідженні нирок тварин, яким протягом 60 діб внутрішньошлунково через зонд вводили ентеросорбент Ентеросгель у дозі 1300 мг/кг, не встановлено змін структурних компонентів нефронів, що відображає нормальний перебіг основних фаз процесу сечоутворення — фільтрації й реабсорбції — та свідчить про відсутність будь-яких морфологічних ознак, які можуть служити маркерами токсичної дії Ентеросгелю.

Результати вивчення впливу препарату Ентеросгель на функціональні показники нирок за умов ниркової недостатності свідчать про те, що Ентеросгель позитивно впливає на функціональний стан нирок, показники білкового обміну і знижує рівень ендогенної інтоксикації в ураженому організмі.