Международный неврологический журнал 4(26) 2009

Вступ

Спінальна м’язова атрофія (СМА) — спадкове захворювання, для якого є характерним розвиток дегенеративного процесу, що захоплює тіла рухових альфа-нейронів передніх рогів спинного мозку, а при окремих формах — також ядер черепно-мозкових нервів. [1, 2].

За сучасною класифікацією розрізняють 3 типи СМА дитячого віку зі збільшенням віку початку і зменшенням тяжкості захворювання від І до ІІІ типу: СМА І типу (хвороба Вердніга — Гоффманна, гостра СМА), СМА ІІ типу (проміжний тип), СМА ІІІ (хвороба Кугельберга — Веландера, хронічна СМА) [3– 5].

Усі гени-кандидати СМА ідентифіковані в хромосомній ділянці 5q13.1. Один із генів, що картований у цій хромосомній ділянці, — SMN (від англ. survival motor neuron gene — «ген виживання рухових нейронів») — представлений у вигляді двох високогомологічних копій, що відрізняються всього за п’ятьма парами нуклеотидів, — теломерний ген SMN1 і центромерний SMN2 [6]. У більшості хворих СМА (від 85 до 98 %) виявляють відсутність 7-го та/чи 8-го екзонів гена SMN1, тоді як відсутність гена SMN2 не призводить до розвитку СМА і зустрічається в 5 % индивідів із загальної популяції. Іншим геном-кандидатом є ген, що кодує білок — інгібітор неврального апоптозу (NAIP, від англ. neuronal apoptosis inhibitory protein gene) [7].

З моменту ідентифікації генів, відповідальних за розвиток СМА, з’явилась можливість проведення прямої молекулярної діагностики родин, у яких є хворі на СМА. Ідентифікація генів СМА дозволяє проводити прямий аналіз мутацій, що підвищує точність і надійність діагностики (замість аналізу зчеплення з великою кількістю ДНК-маркерів). Проте встановлення гетерозиготного носійства мутацій генів SMN1 та NAIP ускладнене через наявність високогомологічних копій цих генів у центромерному елементі дуплікації. Для встановлення статусу гетерозиготного носійства для сибсів хворих та при проведенні дородової діагностики застосовують внутрішньородинний аналіз зчеплення певного алеля поліморфного локусу з мутантним геном.

Метою роботи було проаналізувати поширення делецій 7-го та 8-го екзонів гена SMNI i 5-гo екзону гена NAIP та внутрішньородинне зчеплення VNTR- та STR-маркерів 2AE9.1 (D5S557) та LAS96 (D5S681) із хромосомної ділянки 5q13.1 у сім’ях високого ризику з України.

Матеріали та методи досліджень

Матеріалом дослідження були зразки крові хворих на спінальну м’язову атрофію та членів їх родин, що були отримані за умови інформованої згоди. ДНК із ядер лейкоцитів свіжоотриманої крові виділяли за допомогою стандартного методу — шляхом гідролізу лізатів клітин протеїназою К із подальшою фенольною екстракцією [8].

Аналіз делецій 7-го и 8-го екзонів генів SMN1 та SMN2 проводили після гідролізу продуктів ампліфікації in vitro відповідних послідовностей ендонуклеазами рестрикції DraI и DdeI відповідно при температурі 37 °С протягом 3–5 годин у 2% агарозному гелі [9].

Аналіз делеції 5-го екзону гена NAIP проводили шляхом ампліфікаціі з використанням як контролю поліморфного локусу 2AE9.1 із наступною візуалізацією в 1,5% агарозному гелі.

Для аналізу алельного поліморфізму локусів 2AE9.1 (D5S557) та LAS96 (D5S681) проводили ампліфікацію in vitro специфічних послідовностей ДНК, що містять ці локуси. Для точного визначення алельних варіантів кожного із досліджуваних локусів нами були використані мічені флюоресцетною міткою Cy5 праймери для ПЛР із наступним електрофоретичним розділенням на лазерному флюорометрі ALF express II (Amersham Bioscience). Аналіз ПЛР-фрагментів проводили за допомогою пакету програм (Fragment Manager Software V2.1, Pharmacia)

Результати та обговорення

Продукти ампліфікації 7-го екзону генів SMN1 та SMN2 мають однаковий розмір — 188 п.н. Розрізнити їх можна завдяки тому, що продукт ампліфікації 7-го екзону гена SMN2 має сайт пізнавання для ендонуклеази рестрикції DraI. У зразках ДНК хворих на СМА, які мають гомозиготну делецію 7-го екзону гена SMN1, на електрофореграмі визначаються лише гідролізовані продукти ампліфікації (фрагменти розміром 164 та 24 п.н.), що відповідають 7-му екзону гена SMN2. Якщо на електрофореграмі спостерігали лише негідролізований продукт ПЛР розміром 188 п.н., то це свідчило про делецію послідовності 7-го екзону гена SMN2 у даного індивіда. В індивідів, які мають хоча б одну копію генів SMN1 чи SMN2, були визначені як гідролізовані (відповідають послідовності гена SMN2), так і негідролізовані продукти ампліфікації (відповідають послідовності гена SMN1) (рис. 1). Як і у випадку 7-го екзону, продукти ампліфікації 8-го екзону генів SMN1 та SMN2 мають однаковий розмір (189 п.н.). Відрізнити їх можна завдяки тому, що у 8-му екзоні гена SMN2 знаходиться сайт пізнавання для ендонуклеази рестрикції DdeI. Якщо на електрофореграмі визначаються лише ці гідролізовані продукти ампліфікації, то це свідчить про відсутність у даного індивіда послідовності 8-го екзону гена SMN1 (хворі на СМА). Наявність на електрофореграмі лише негідролізованого фрагменту розміром 189 п.н. означає відсутність у даного індивіда послідовності 8-го екзону гена SMN2. Якщо ж на електрофореграмі спостерігали як гідролізовані (відповідають гену SMN2), так і негідролізовані (відповідають гену SMN1) продукти ампліфікації, то це свідчило про наявність у даного індивіда хоча б однієї копії послідовностей 8-го екзону генів SMN1 i SMN2 (рис. 2).

Гомозиготна делеція 7-го та 8-го екзонів гена SMN1 була виявлена у 145 з 375 проаналізованих хворих (39 %). У 27 хворих виявлена гомозиготна делеція лише 7-го екзону гена SMN1 (7 %).

Продукт ампліфікації 5-го екзону гена NAIP становить 435 п.н. (рис. 3).

Гомозиготна делеція 5-го екзону гена NAIP була виявлена у 85 з 375 хворих дітей (23 %), причому в цих дітей спостерігалася також гомозиготна делеція 7-го та 8-го екзонів гена SMN1. Встановлено асоціацію між наявністю протяжної делеції, що захоплює 7-й та 8-й екзони гена SMN1 i 5-й екзон гена NAIP, та тяжкістю СМА. У переважній більшості випадків (за винятком одного хворого, який мав II тип СМА) дана делеція була виявлена тільки в пацієнтів із найтяжчим (I) типом захворювання (хвороба Верднiга — Гоффманна) [10].

Дослідження алельного поліморфізму локусів 2AE9.1 (D5S557) та LAS96 (D5S681) проведено також серед 142 з 375 родин високого ризику СМА. Пренатальну ДНК-діагностику було проведено в 72 родинах. У 16 (22 %) випадках у матеріалі плода були виявлено ті ж мутації генів SMN1 і NAIP, що й у пробандів із цих родин. Діагностична інформативність аналізу делецій у 49 родинах була додатково підтверджена за результатами аналізу поліморфних локусів 2AE9.1 (D5S557) та LAS96 (D5S681).

Останнім часом велика увага приділяється розробці методів аналізу кількості копій генів SMN1 та SMN2. Дуже перспективним у цьому плані ввважається використання методу ПЛР у реальному часі [11]. Такий аналіз копійності дозволить із високою точністю визначати носіїв мутантних генів у програмах масового скринінгу, а також відкриє перспективи для більш ефективного лікування хворих на СМА, у яких буде визначена висока копйність генів SMN2.

Висновки

Установлено, що провідну роль у розвитку спінальної м’язової атрофії всіх клінічних форм відіграють мутації 7-го та 8-го екзонів гена SMN2. Встановлено асоціацію між типом мутації та тяжкістю СМА. Протяжна делецiя, що захоплює 7-й та 8-й екзони гена SMN2 i 5-й екзон гена NAIP, виявлена у 23 % хворих на СМА i переважає в пацієнтів із найтяжчим (I) типом захворювання (хвороба Верднiга — Гоффманна). Отримані нами дані свідчать про високу інформативність використання аналізу мутацій 7-го та 8-го екзонів гена SMN2 і 5-го екзону гена NAIP та алельних варіантів STR-локусів 2AE9.1 (D5S557) і LAS-96 (D5S681) для діагностики СМА (включаючи пренатальну) та встановлення гетерозиготного носійства цього захворювання.