Международный эндокринологический журнал 5 (29) 2010

Введение

Образования надпочечников обладают как клиническими, так и морфологическими особенностями, связанными со сложностью гистогенеза и строения этой железы. Дефекты в специфичной для зон экспрессии стероидогенных ферментов могут вызвать клинические нарушения стероидогенеза. Как подчеркивается в описании путей стероидогенеза, ключевым компонентом функционального разделения на зоны является специфическая для каждой зоны экспрессия ферментов цитохромов P450 (CYP), которые катализируют различные модификации предшественников стероидов. Внешняя клубочковая зона экспрессирует альдостеронсинтазу (CYP11B2), которая катализирует три отдельных реакции для превращения 11-дезоксикортикостерона в альдостерон: 11 b -гидроксилирование, 18-гидроксилирование и окисление 18-гидроксила до альдегидной части [1].

Безусловно, вклад гена CYP11B2 в развитие артериальной гипертензии (АГ), как и часто диагностируемых при АГ адренальных инциденталом (АИ), представляет большой интерес, так как исследования по полиморфизму гена альдостеронсинтазы у больных с АИ практически не проведены ни в узбекской популяции, ни в мире.

Описано несколько полиморфизмов гена альдостеронсинтазы: C-344Т, Lys-173Arg, интрон-1, K173R, интрон-2, T4986C и A6547G [2, 3]. Наиболее изучен полиморфизм в 5''-конце этого гена — замена цитозина тимидином в -344-й позиции, который участвует в связывании фактора транскрипции SF-1 и таким образом может влиять на экспрессию гена.

Ряд исследований показал ассоциацию С-344Т полиморфизма гена CYP11B2 с АГ и позитивную корреляцию с уровнем альдостерона плазмы. Так, по данным E. Brand и соавт., распространенность -344Т-аллеля у гипертоников французской популяции была выше, чем у здоровых лиц, и -344Т-аллель ассоциировался с АГ [4]. В работе E. Davies и соавт. также отмечено большее накопление -344Т-аллеля у гипертоников и показано, что его носители имели большую экскрецию альдостерона по сравнению с СС-гомозиготами [5]. Однако исследование, проведенное среди 420 европейских студентов, показало, что -344С-аллель был независимым фактором повышения САД у мужчин (ТТ-генотип — 125,6, ТС-генотип — 128,4, СС-генотип — 130,5 мм рт.ст.), р = 0,03 [6], а в исследовании L. Pogoja [3] было продемонстрировано, что наличие -344С-аллеля ассоциируется с высоким уровнем альдостерона плазмы (90 ± 8 пг/мл — при ТТ-генотипе, 110 ± 6 пг/мл — при ТС-генотипе, 129 ±
± 10 пг/мл — при СС-генотипе). В то же время H. Schunkert и соавт. не находят ассоциацию между С-344Т полиморфизмом гена CYP11B2, АД и альдостероном [7].

Японские исследователи определили высокую частоту -344С-аллеля у больных с АГ. Также было отмечено, что -344С-аллель ассоциировался с развитием АГ, высоким уровнем соотношения альдостерон/ренин плазмы, позволившими сделать заключение о том, что -344С-аллель является генетическим маркером низкорениновой гипертонии у японцев [8], в то же время как другие исследователи сообщили о низкой частоте -344С-аллеля среди больных низкорениновой гипертонией [9]. По данным A.D. Tiago и соавт., С-344Т полиморфизм гена CYP11B2 у африканцев ассоциировался с высоким САД по данным суточного мониторирования АД и офисных измерений [10]. Таким образом, накопленные данные по С-344Т полиморфизму гена CYP11B2 демонстрируют отсутствие однозначных фактов по связи анализирующих полиморфизмов с АГ даже в пределах этнических групп.

Цель исследования — изучить распределение С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 и возможную связь указанного полиморфизма с гормональными, биохимическими и морфофункциональными параметрами анализа у больных с АИ.

Материалы и методы исследования

Основой нашего исследования явились клинические наблюдения за 80 больными узбекской национальности с АИ, находившимися на стационарном и амбулаторном лечении и наблюдении в клинике РСНПМЦ эндокринологии МЗ РУз. Группой контроля послужили 60 здоровых лиц, аналогичных по возрасту и полу основной группе. Диагноз АИ был верифицирован на основании клинико-биохимических, гормональных и визуализационных исследований. Всем пациентам проводили общеклиническое обследование, биохимический анализ крови с определением сывороточного уровня калия, натрия, хлора, липидного спектра, гликемии натощак и в ходе орального глюкозо-толерантного теста, креатинина и мочевины; гормональные исследования крови, в том числе исследования концентрации альдостерона сыворотки крови и активности ренина плазмы в горизонтальном положении, адренокортикотропного гормона, кортизола, 11-оксикортикостероидов (11-ОКС), а также суточную экскрецию катехоламинов и 17-кетостероидов (17-КС) с суточной мочой. Для топической диагностики использовали ультразвуковое исследование и компьютерную томографию надпочечников.

Генотипирование 80 образцов цельной крови на С(-344)Т полиморфизм гена CYP11B2 произведено на базе Республиканского специализированного центра кардиологии МЗ РУз в лаборатории артериальной гипертензии группой молекулярно-генетических исследований. Выделение геномной ДНК производилось с помощью набора DIAtom™ DNA Prep200 (Лаборатория ИзоГен, Россия).

Постановка полимеразной цепной реакции проводилась с использованием набора для генотипирования на полиморфный маркер T(-344)C гена CYP11B2 (GenTest, Россия) на амплификаторе GeneAmp ® PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) (табл. 1).

Использовались следующие последовательности праймеров:

Прямой праймер:

5`-AGGGCTGAGAGGAGTAAAATG-3`;

Обратный праймер:

5`-TGACCACCAGGAGGAGAC-3`.

Детекция результатов амплификации производилась с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле при напряженности поля ~ 15 V/см в течение 30 минут. В качестве электрофоретического буфера использовался 1 ´ SB буфер (GenTest, Россия). Гели окрашивались раствором бромистого этидия с последующим просмотром в ультрафиолетовом свете ( l = 254 нм) на трансиллюминаторе ECX-15M (Vilber Lourmat, Франция). Полученные результ аты документировались фотографированием с помощью системы гельдокументирования Gel Imager-2 (Helicon, Россия).

В результате электрофоретической детекции в геле определялся фрагмент длиной 537 п.н., соответствующий амплифицированному участку ДНК, содержащему полиморфную последовательность С(-344)Т гена CYP11B2.

Для определения генотипа производилась последующая рестрикция продуктов амплификации при помощи рестриктаз BsuR и HaeIII с использованием набора для генотипирования на полиморфный маркер С(-344)Т гена CYP11B2 (GenTest, Россия) при температуре 37 °C в течение 16 часов.

Детекция результатов рестрикции амплифицированных фрагментов производилась с помощью горизонтального электрофореза в 4% агарозном геле при напряженности поля ~ 8 V/см в течение 2 часов. В качестве электрофоретического буфера использовался 1 ´ SB буфер (GenTest, Россия). Гели окрашивались раствором бромистого этидия с последующим просмотром в ультрафиолетовом свете ( l = 254 нм) на трансиллюминаторе ECX-15M (Vilber Lourmat, Франция). Полученные результаты документировались фотографированием с помощью системы гельдокументирования Gel Imager-2 (Helicon, Россия).

При электрофоретическом разделении продуктов рестрикции в геле выявлялись разные наборы специфичных фрагментов ДНК: фрагменты длиной 274, 138, 126 п.н. соответствовали гомозиготному генотипу TT, фрагменты 203, 138, 126 и 71 п.н. — гомозиготному генотипу CC и фрагменты 274, 203, 138, 126 и 71 п.н. – гетерозиготному генотипу TС.

Результаты исследования и обсуждение

У обследованных больных распределение С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 было следующим: ТТ-генотип выявлен у 19 больных (23,75 %), СТ-генотип — у 43 (53,75 %), СС-генотип — у 18 (22,5 %), c 2  = 22,538, р = 0,000. При этом Т-аллель выявлен в 81 случае (50,6 %), С-аллель — 79 (49,4 %), c 2 = 0,013, р = 0,911. Анализ полученных результатов указывает на преобладание СТ-гетерозигот по С-344Т полиморфному маркеру гена CYP11B2 у больных узбекской национальности, страдающих адренальными инциденталомами (рис. 1).

В группе здоровых лиц подобного рода анализ в распределении генотипов С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 выявил также высокую частоту СТ-гетерозигот — 30 пациентов (51,7 %) и равномерное распределение гомозиготных форм: ТТ-генотип — 15 пациентов (25,8 %), СС-генотип — 13 (22,4 %), c 2 = 13,4, р = 0,000. Следует отметить, что как у здоровых, так и у больных частота аллелей С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 не различалась: Т-аллель был отмечен у 60 (51,7 %), С-аллель — у 56 (48,3 %), р = 0,69, c 2 = 0,15 (рис. 2).

Описанное распределение С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 у больных и здоровых соответствует теоретическому расчету частот генотипов и аллелей по Харди — Вайнбергу.

Результаты электрофореза ПЦР продуктов амплификации С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 у обследуемых больных показаны на рис. 3.

Распределение генотипов и аллелей С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 у больных и здоровых лиц узбекской национальности соответствовало таковому у европеоидов. В отличие от указанного у лиц японской популяции отмечалась большая распространенность ТТ-гомозигот при отсутствии СС-гомозигот [11]. Интересно отметить, что наибольшее носительство ТТ-генотипа и Т-аллеля было зафиксировано у южноафриканцев [10].

Таким образом, проведенные исследования указывают на различие в носительстве полиморфных маркеров гена CYP11B2 с учетом этнических особенностей.

С целью оценки особенностей гемодинамики у больных адренальными инциденталомами с учетом С-344Т полиморфизма гена CYP11B2 были выделены группы больных с СС-, СТ- и ТТ-генотипами, а также с носительством С-аллеля и Т-аллеля.

Как отмечено на рис. 4, носительство указанных генотипов и аллелей не ассоциировалось со степенью АГ и ЧСС.

При анализе ассоциаций носительства полиморфных маркеров гена CYP11B2 с параметрами гормонального статуса, электролитного баланса, показателями липидного спектра крови выявлен ряд особенностей (табл. 2, 3).

Так, у ТТ-гомозигот по сравнению с СС-гомозиготами были отмечены более высокие средние значения альдостерона: 85,22 ± 54,80 пг/мл против 55,94 ± 24,17 пг/мл, р = 0,045. При этом наиболее высокие значения альдостерона были выявлены у СТ-гетерозигот: 111,40 ± 62,94 пг/мл, что с высокой степенью достоверности отличалось от носителей СС-генотипа (р = 0,000). При этом следует отметить, что уровень 11-ОКС — предшественника альдостерона был наименьшим в группе ТТ-гомозигот по сравнению с СС-гомозиготами: 8,99 ± 1,23 мкг% против 9,91 ± 1,03 мкг% (р = 0,019), что, по-видимому, может быть обусловлено его ускоренным потреблением. Уровень калия в сыворотке крови достоверно отличался наименьшими значениями у носителей ТТ-генотипа по сравнению с СС-гомозиготами: 4,09 ± 0,39 ммоль/л против 4,47 ± 0,59 ммоль/л (р = 0,026). При этом уровень натрия у ТТ-гомозигот достоверно превышал таковой у СТ-гетерозигот: 143,05 ± 9,52 ммоль/л против 138,02 ± 7,56 ммоль/л (р = 0,03). Полученные результаты объясняются особенностями функционирования калий-натриевого насоса и обратной регулирующей ролью калия в синтезе альдостерона, что нашло наиболее выраженное проявление у носителей ТТ-генотипа. Превалирование уровней альдостерона у ТТ-гомозигот и носителей СТ-гетерозиготного состояния по С-344Т полиморфному маркеру гена CYP11B2 нашло отражение в характере АГ, очевидно, низкорениновой, что может быть описано наличием достоверных отрицательных корреляций между ренином и параметрами САД и ДАД. Так, у носителей Т-аллеля: r ренин /САД = –0,31 и r ренин /ДАД = –0,22, у СТ-гетерозигот: r ренин /САД = –0,40 и r ренин /ДАД = –0,36. При проведении сравнительного анализа частоты встречаемости нарушений углеводного обмена с учетом носительства С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 отмечена достоверно большая частота НТГ у лиц — носителей СТ-генотипа по сравнению с носителями СС-генотипа: 10 (23,6 %) против 1 (5,55 %) соответственно, c 2 = 7,324, р = 0,026. Следует отметить, что в единственной работе по изучению ассоциации С-344Т полиморфизма гена CYP11B2 с параметрами гликемии, проведенной среди 1368 японцев и китайцев, у носителей СС-генотипа по сравнению с носителями Т-аллеля были отмечены достоверно более высокие значения уровня глюкозы натощак [12]. В этом аспекте полученные нами данные противоположного характера могут быть объяснены различиями в распределении и функциональной направленности С-344Т полиморфизма гена у европеоидов (схожесть узбекской популяции с европеоидами по распределению полиморфизмов генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы была продемонстрирована в отечественной литературе [13]), японцев и китайцев).

Выводы

1. У больных с адренальными инциденталомами, а также здоровых лиц узбекской национальности отмечена высокая частота СТ-генотипа при равномерном распределении С- и Т-аллелей С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2.

2. Носительство СТ- и ТТ-генотипов С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2 сопряжено с более высокими значениями альдостерона в сыворотке крови больных адренальными инциденталомами, при этом ТТ-гомозиготы достоверно отличались низкими значениями калия и высоким уровнем натрия в сыворотке крови; носительство СТ-генотипа гена CYP11B2 сопряжено с риском развития НТГ у больных с адренальными инциденталомами.

3. Анализ корреляционных связей между параметрами АД и гормональным статусом указывает на гипорениновый характер АГ, ассоциированной с носительством Т-аллеля С-344Т полиморфного маркера гена CYP11B2.