Международный эндокринологический журнал 7 (31) 2010

1α,25-дигидроксивитамин D3 (1α,25(OH)2D3, или кальцитриол), активная и гормональная форма витамина D, и его предшественник 1α,25-гидроксивитамин D3 (1α,25(OH)D3, или альфакальцидол) широко используются для лечения различных метаболических болезней костей, включая почечную остеодистрофию, рахит/остеомаляцию и остеопороз [1]. Несмотря на то что был достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов генной регуляции, осуществляемой активными формами витамина D [2], механизмы действия на тканевом уровне, особенно в костях, продолжают оставаться невыясненными.

1α,25(OH)2D3 играет главную роль в поддержании кальциевого (Са) и костного гемостаза путем связывания с ядерным рецептором витамина D (VDR) в классических органах-мишенях, включая кишечник, кости, почки и паращитовидные железы [1]. Было выяснено, что 1α,25(OH)2D3 стимулирует абсорбцию Са в кишечнике, резорбцию, равно как и образование, костей, реабсорбцию Са в дистальных почечных канальцах, подавляет генную транскрипцию паратиреоидного гормона (ПТГ) и кальцитонина в паращитовидных железах и щитовидной железе соответственно [1].

Хорошо известно, что 1α,25(OH)2D3 проявляет анаболическое действие в отношении костной ткани у животных с дефицитом витамина D [3, 4]. При этом 1α,25(OH)2D3 делает следующее: 1) увеличивает абсорбцию Са в кишечнике, повышая его уровень в плазме крови и экскрецию с мочой; 2) снижает содержание ПТГ в плазме крови путем прямого ингибирования секреции/синтеза ПТГ за счет связывания с VDR паращитовидных желез, а также путем непрямого ингибирования секреции ПТГ за счет повышения концентрации Са в плазме крови; 3) уменьшает резорбцию костей вследствие снижения содержания ПТГ и 4) увеличивает образование костной ткани путем влияния на Са и фосфатный гомеостаз [5].

Напротив, влияние активного метаболита витамина D на кости в условиях избытка витамина D остается неясным. Если говорить более конкретно, то нужно выяснить, будут ли наблюдаемые костные эффекты только лишь следствием повышения содержания Са в плазме крови и моче (отражение стимулированной абсорбции Са), и если так, то является ли снижение содержания эндогенного ПТГ необходимым условием для анаболического действия активного метаболита витамина D в костях. Ответ на эти вопросы поможет обосновать использование активного метаболита витамина D, такого как альфакальцидол, для лечения остеопороза, и верифицировать его преимущество перед более дешевым витамином D, который также может нормализовывать баланс Са. Настоящее исследование было проведено для того, чтобы: 1) сравнить предупреждающее влияние альфакальцидола, назначаемого перорально, и витамина D3, назначаемого перорально, на развитие остеопороза и ломкость костей у перенесших овариэктомию крыс среднего возраста в зависимости от кальциевых эффектов обоих препаратов; 2) выяснить, является ли супрессия ПТГ необходимой для проявления костных эффектов препаратов, для чего использовали перенесших паратиреоидэктомию крыс, которым непрерывно вводили ПТГ.

Материалы и методы

Лекарственные средства

Человеческий паратиреоидный гормон (1-34) [чПТГ(1-34)] был выделен в Peptide Institute Inc. (Осака, Япония). 1α(OH)D3 (альфакальцидол) был синтезирован в Chugai Pharmaceutical Co. Ltd, витамин D3 (холекальциферол) был выделен в WAKO Chemical Industries Ltd. (Осака, Япония). Оба вещества растворили в среднецепочном триглицериде (СЦТ).

Дизайн эксперимента

Исследования на крысах, перенесших овариэктомию. Крысы-самки линии Wistar-Imamichi в возрасте 8 месяцев были приобретены в Imamuchi Institute For Animal Reproduction (Ибараки, Япония) и акклиматизированы к стандартным лабораторным условиям при температуре 23 ± 2 °С и влажности 40–70 %. Крыс содержали в простерилизованных клетках, кормили стандартной пищей для грызунов, содержащей 1,25 % Са и 1,06 % фосфатов (СЕ-2, Clea Japan Inc.), и не ограничивали в доступе к водопроводной воде.

90 крыс были разделены на девять групп. Группа 1 включала неоперированных крыс. Всем остальным крысам выполнили билатеральную овариэктомию (ОВЭ) и разделили на восемь групп: группа 2 — контрольная группа крыс с ОВЭ, группы 3–5 — крысы, получающие лечение альфакальцидолом, группы 6–9 — крысы, получающие лечение витамином D3. Животным групп 1 и 2 давали СЦТ (плацебо) перорально в дозе 1 мл/кг массы тела (МТ). Группы 3–5 получали альфакальцидол пер­орально в дозах 0,025, 0,05 и 0,1 мкг/кг МТ соответственно, пять раз в неделю. Группы 6–9 получали витамин D3 перорально в дозах 50, 100, 200 и 400 мкг/кг МТ соответственно, пять раз в неделю. Длительность эксперимента составила 12 недель.

Исследования на крысах, перенесших паратиреоидэктомию. Крысы-самцы линии Spraque-Dawley в возрасте 7 недель были приобретены в Clea Japan Inc. (Токио, Япония) и содержались так, как описано выше. 36 крыс были случайно разделены на пять групп. Группа 1 включала неоперированных крыс, группы 2–5 включали крыс, которым выполнили паратиреоидэктомию (ПТЭ) (операции выполняли на 0-й день). ПТЭ считали успешной, если по состоянию на 1-й день уровень ионизированного кальция (Са2+) в крови был ниже 1,15 ммоль/л. ПТЭ-крысы были разделены на четыре группы: группа 2 — ПТЭ-контроль, группа 3 — ПТЭ + ПТГ + плацебо, группа 4 — ПТЭ + ПТГ + альфакальцидол 0,1 мкг/кг МТ, группа 5 — ПТЭ + ПТГ + альфакальцидол 0,2 мкг/кг МТ. ЧПТГ(1-34) в дозе 2,4 мкг/день или его плацебо (150 мМ раствора натрия хлорида, содержащего 2% цистеин-HCl, pH 1,5) непрерывно вводились с помощью осмотического насоса (мининасос Alzet) в течение 14 дней. Альфакальцидол и его плацебо давались перорально девять раз во время 14-дневного экспериментального периода. Через заданные интервалы времени мониторировали уровень Са2+ в крови; животных умерщвляли на 14-й день эксперимента.

Исследования на животных были выполнены в соответствии с руководством по этике работы с животными Chugai Pharmaceutical. Протоколы эксперимента были одобрены Комитетом по биоэтике.

Биохимический анализ

После последнего приема пищи животные голодали в течение 24 ч. В этот период собирали мочу. Кровь забирали из абдоминальной аорты в условиях эфирного наркоза. Образцы крови и мочи центрифугировали, для того чтобы получить супернатант плазмы или мочи, которые сохраняли при температуре –20 °С до момента проведения замеров. Содержание Са и фосфатов в плазме крови и моче определяли с помощью аутоанализатора (Hitachi 7170; Токио, Япония). Содержание Са2+ в крови определяли электродным методом с помощью аутоанализатора (Cairon Co. Ltd., Токио, Япония). Содержание в моче дезоксипиридинолина измеряли с помощью наборов PYRILINKS-D (Metra Biosystems Inc., США).

Исследование костей

Для исследования костей были взяты поясничные позвонки, бедро и большеберцовая кость. L5 позвонок был отделен и сохранялся при температуре –20 °С для измерения механической прочности. Другие позвонки (L2–L4) сохранялись в 70% этаноле при температуре 4 °С для определения минеральной плотности костной ткани (МПКТ). Левое бедро сохраняли при –20 °С, правое бедро фиксировали в 70% этаноле при 4 °С для измерения механической прочности и МПКТ соответственно.

Измерение минеральной плотности костной ткани (мг/см2) поясничных позвонков и правого бедра осуществляли с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ДРА) (DCS-600 Aloka, Япония). Во время проведения анализа бедро было поделено на 10 равных областей вдоль его основной оси, и средние значения МПКТ для трех наиболее проксимальных областей (1–3-я), следующих четырех сканируемых областей (4–7-я) и трех наиболее дистальных сканируемых областей (8–10-я) отражали плотность проксимальной, средней и дистальной частей бедра соответственно.

Гистология костей. Были приготовлены срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, для гистопатологического исследования проксимальных отделов большеберцовых костей. С этой целью после некропсии большеберцовые кости фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, декальцифицировали в 10% ЭДТА и заливали парафином. Парафиновые срезы (3 мкм) окрашивали с помощью гематоксилина и эозина для исследования под световым микроскопом.

Тесты на прочность. Левое бедро использовали для измерения механической прочности с помощью теста на трехточечный изгиб. Изгибающую силу прикладывали со скоростью 6 мм/мин до тех пор, пока не происходил перелом. Для измерения механической прочности тела 5-го поясничного позвонка использовали компрессионный тест. После удаления краниального и каудального концов от каждого тела позвонка был получен центральный цилиндр с плоскопараллельными концами высотой примерно 5 мм. Для проведения замеров цилиндры помещали в прибор для нагрузочного теста (TK-252C: MUROMACHI KIKAI Co. Ltd., Япония). Для того чтобы приложить компрессионную силу к образцу, использовали стальной диск, перемещавшийся с деформационной скоростью 10 мм/мин. Предел прочности на разрыв (максимальная нагрузка: N) получали прямо из кривой «нагрузка — деформация» [6].

Статистический анализ

Результаты выражали в виде средних значений ± ± стандартная ошибка. Статистический анализ выполняли с помощью программы SAS (Statistic Analysis System). Достоверность различий определяли с помощью ANOVA и множественных сравнений Даннетта (рис. 6 и 7) или t-критерия Стьюдента (рис. 3 и 5). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Протективное влияние альфакальцидола и витамина D3 на кости как функция концентрации Са в плазме крови

У 8-месячных ОВЭ-крыс изучили влияние альфакальцидола и витамина D3 на остеопороз, вызванный дефицитом эстрогенов. Увеличивающиеся дозы альфакальцидола и витамина D3 назначали пять раз в неделю в течение 3 месяцев, начиная со 2-й недели после ОВЭ. В результате оказалось, что и альфакальцидол, и витамин D3 увеличивали МПКТ в дозозависимой манере, что согласовывалось с небольшим (в пределах нормального диапазона) увеличением содержания Са в плазме крови. Для того чтобы более детально оценить взаимосвязь между способностью обоих препаратов повышать содержание кальция и оказывать протективное влияние на кости, значения МПКТ были отмечены на оси координат против соответствующих им значений концентрации Са (рис. 1). Видно, что в исходных условиях МПКТ средней части бедра значительно снижалась у ОВЭ-крыс по сравнению с неоперированными животными. После назначения животным увеличивающихся доз альфакальцидола и витамина D3 была обнаружена положительная корреляция между ростом МПКТ и повышением концентрации Са. Однако необходимо отметить, что кривая альфакальцидола поднимается более круто, чем кривая витамина D3, и проходит через значения для неоперированных животных. Аналогичные данные были получены и для МПКТ в проксимальных и дистальных частях бедра (данные не представлены). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при фиксированной концентрации Са в плазме крови альфакальцидол более эффективно увеличивает МПКТ по сравнению с витамином D3 и что более высокие дозы витамина D3 требуются для того, чтобы достичь такого же уровня МПКТ.

Было изучено также влияние обоих препаратов на прочность костей (рис. 2). И хотя прочность костей увеличивалась по мере роста концентрации Са на фоне приема обоих препаратов, кривая для альфакальцидола была более крутой, чем для витамина D3. Необходимо отметить, что влияние витамина D3 на прочность достигало плато при дозе 200 мкг/кг МТ, и что доза 400 мкг/кг не приводила к соответствующему увеличению плотности костей. Такие же результаты были получены и в том случае, когда значения МПКТ и прочности костей были отмечены против экскреции Са с мочой (данные не представлены). Следовательно, полученные данные свидетельствуют о том, что при одном и том же уровне кальция в плазме крови/моче альфакальцидол более эффективен, чем витамин D3, в отношении увеличения костной массы и прочности костей, сниженных при дефиците эстрогенов.

Для того чтобы еще лучше прояснить полученные данные, костные эффекты альфакальцидола и витамина D3 оценили при заданной концентрации Са в плазме крови — менее 10 мг/дл. Как следует из рис. 3, альфакальцидол достоверно увеличивает прочность костей по сравнению с исходным состоянием крыс после ОВЭ, в то время как витамин D3 не делает этого. Таким образом, альфакальцидол оказывает протективное влияние на кости в дозах, которые не вызывают гиперкальциемии. В то же время могут потребоваться большие дозы витамина D3, чтобы вызвать такие же увеличивающие массу эффекты в костях; при этом будет наблюдаться гиперкальциемия и нарушение прочности костей.

Альфакальцидол ингибирует резорбцию костей более эффективно, чем витамин D3. Чтобы заглянуть в механизмы, с помощью которых альфакальцидол проявляет протективное действие в костях, оценили экскрецию с мочой дезоксипиридинолина (маркер костной резорбции) как показатель содержания Са в плазме крови. Как следует из рис. 4, и альфакальцидол, и витамин D3 дозозависимо снижали содержание дезоксипиридинолина в моче, однако кривая для альфакальцидола была более крутой, чем для витамина D3. Когда данные проанализировали для животных с содержанием Са в плазме крови ниже 10 мг/дл (рис. 5), стало видно, что ОВЭ приводила к существенному повышению экскреции дезоксипиридинолина с мочой, которая с помощью альфакальцидола была снижена почти до того же уровня, что и у неоперированных крыс. Назначение витамина D3 в дозах, поддерживающих концентрацию Са ниже 10 мг/дл, не приводило к достоверному подавлению экскреции дезоксипиридинолина (рис. 5).

Протективное влияние альфакальцидола на кости без супрессии ПТГ

Для того чтобы определить, является ли супрессия эндогенного ПТГ необходимым условием для костных эффектов альфакальцидола, изучили влияние этого препарата на кости и кальциевый метаболизм у перенесших паратиреоидэктомию крыс, у которых относительная нормокальциемия поддерживалась путем непрерывной инфузии чПТГ(1-34) с помощью осмотических мини-насосов. Этим животным с фиксированным уровнем ПТГ назначали перорально альфакальцидол в увеличивающихся дозах девять раз в течение 14-дневного экспериментального периода. После этого животных умерщвляли, а кости забирали на анализ. Как следует из рис. 6, после успешной ПТЭ наблюдались гипокальциемия (≈ 5 мг/дл) и гиперфосфатемия (≈ 12 мг/дл); непрерывная инфузия чПТГ(1-34) приводила к увеличению содержания Са в плазме крови до 8 мг/дл вместе со снижением содержания фосфатов в плазме крови до 9 мг/дл. Назначение альфакальцидола не приводило к достоверным изменениям содержания Са в плазме крови.

Влияние альфакальцидола на МПКТ у ПТЭ-крыс, которым вводили чПТГ(1-34), представлено на рис. 7. Во время 2-недельного периода альфакальцидол дозозависимо увеличивал МПКТ. Анаболический эффект альфакальцидола был также подтвержден гистологическим анализом проксимальных отделов большеберцовой кости (рис. 8). Назначение альфакальцидола ПТЭ-крысам, которым вводили ПТГ, приводило к увеличению объема трабекулярной кости. Поверхность кости у животных, получавших альфакальцидол, была выстлана большими кубовидными клетками, напоминающими активные остеобласты (данные не представлены). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что протективное влияние альфакальцидола на кости не зависит от уровня ПТГ. Это согласуется с нашей концепцией о том, что влияние альфакальцидола на кости, по крайней мере отчасти, осуществляется независимо от его влияния на абсорбцию Са и результирующей супрессии секреции ПТГ.

Обсуждение

Остеопороз является системным заболеванием костей, которое характеризуется снижением костной массы и повышением риска переломов костей [7]. Для лечения постменопаузального остеопороза, развивающегося вследствие дефицита эстрогенов, широко используют гормонозаместительную терапию (ГЗТ) [8]. Однако при этом развивается ряд неблагоприятных побочных эффектов, таких как вагинальные кровотечения и риск развития гормональнозависимого рака.

Препараты витамина D в целом хорошо переносятся, и накоплено достаточно данных в пользу их использования при лечении остеопороза [9]. Дефицит витамина D и низкое потребление Са в пожилом возрасте приводит к повышению уровней ПТГ, что также вносит вклад в высокую распространенность остеопороза. Было показано, что прием витамина D и Са снижает выраженность остеопороза и частоту невертебральных переломов [10,11]. У лиц пожилого возраста было зафиксировано нарушение образования 1α,25(ОН)2D3 в почках [12, 13] и снижение чувствительности кишечника к 1α,25(ОН)2D3 [14], что также нарушает абсорбцию Са и приводит к отрицательному балансу Са. Во всех этих случаях 1α,25(ОН)2D3 предпочтительно назначать в дозах, превышающих фармакологические дозы витамина D, что может привести к интоксикации витамином D вследствие его длительной задержки в мягких тканях [9]. В одних рандомизированных проспективных клинических исследованиях, изучавших МПКТ при постменопаузальном остеопорозе, было показано, что 1α,25(ОН)2D3 эффективно снижает выраженность остеопороза [15, 16], в то время как в других подобные эффекты получены не были [17], возможно, вследствие использования более низких доз препарата. В 3-летнем проспективном многоцентровом одиночном слепом исследовании, включавшем 622 женщины с компрессионными переломами позвонков, было показано, что лечение 1α,25(ОН)2D3 приводит к снижению частоты новых вертебральных переломов [18]. В клиническом исследовании из Японии также было показано, что альфакальцидол — предшественник D-гормона, который в организме превращается в кальцитриол (D-гормон), увеличивает плотность костей и уменьшает частоту переломов позвонков [19].

В дополнение к стимуляции абсорбции Са в кишечнике 1α,25(ОН)2D3 усиливает реабсорбцию Са в почках, работая в содружестве с ПТГ. Общепризнано, что эти механизмы поддержания позитивного баланса Са лежат в основе протективного действия 1α,25(ОН)2D3 на кости. В самом деле, наши данные свидетельствуют о том, что и альфакальцидол, и витамин D3 увеличивают МПКТ и прочность костей, одновременно увеличивая содержание Са в плазме крови и моче. Это предполагает, что костные эффекты этих препаратов зависят от их кальциевых эффектов. Важным, однако, является тот факт, что наши данные, соотнесенные с кальциевыми эффектами, свидетельствуют о том, что альфакальцидол увеличивает костную массу и улучшает качество костей более эффективно, чем витамин D3, при заданном уровне Са. Это указывает на то, что протективное влияние альфакальцидола на кости, по крайней мере отчасти, реализуется независимо от его влияния на нормализацию Са-баланса. Несмотря на то что механизмы, с помощью которых активная форма витамина D оказывает положительное влияние на кости, остаются неизвестными, наши результаты указывают на то, что альфакальцидол подавляет резорбцию костей после повышения костного ремоделирования вследствие дефицита эстрогенов.

Хорошо известно, что большие дозы 1α,25(ОН)2D3 приводят к стимуляции остеокластной резорбции костей вследствие индукции образования остеокластогенез-поддерживающих молекул в стромальных клетках костного мозга, недавно идентифицированных как RANKL/TRANCE [20, 21]. Этот феномен, наблюдаемый in vitro, противоречит нашим данным и данным других исследователей [22–25] in vivo, поскольку было показано, что в дозах, не приводящих к развитию гиперкальциемии, активный метаболит витамина D3 повышает костную массу, по крайней мере отчасти, за счет подавления костной резорбции. Исходя из данных о том, что костные протективные эффекты альфакальцидола наблюдаются при постоянных уровнях ПТГ (рис. 7), разумно допустить, что активный метаболит витамина D3 ингибирует костную резорбцию независимо от супрессии ПТГ. Необходимо проводить дальнейшие исследования, чтобы уточнить механизмы, с помощью которых активный метаболит витамина D3 тормозит резорбцию костей, особенно при состояниях со значительной костной резорбцией, таких как дефицит эстрогенов (настоящее исследование) или поражение костей, индуцированное раком [26].

Перевод к.м.н. А.В. Савустьяненко