Журнал «Здоровье ребенка» 1 (28) 2011

В здоровом теле — здоровый выдох!

В.А. Скрупский

Одним из важных направлений современной медицины является неинвазивная диагностика. Актуальность проблемы обусловлена щадящими методическими приемами забора материала для анализа, когда пациенту не приходится испытывать боль, физический и эмоциональный дискомфорт; безопасностью исследований ввиду невозможности заражения инфекциями, передающимися через кровь или инструментарий. Неинвазивные методы диагностики могут применяться, с одной стороны, в амбулаторных условиях, что обеспечивает их широкое распространение; с другой стороны — у пациентов в реанимационном отделении, т.к. тяжесть состоянии больного не является противопоказанием для их выполнения. В последнее время в мире возрос интерес к исследованию выдыхаемого воздуха (ВВ) как неинвазивному методу диагностики бронхолегочных, сердечно-сосудистых, желудочно-кишечных и других заболеваний.

Известно, что функциями легких, помимо респираторной, являются метаболическая и выделительная. Именно в легких подвергаются ферментативной трансформации такие вещества, как серотонин, ацетилхолин и, в меньшей степени, норадреналин. Легкие обладают самой мощной ферментной системой, разрушающей брадикинин (80 % брадикинина, введенного в легочный кровоток, инактивируются при однократном прохождении крови через легкие). В эндотелии легочных сосудов синтезируются тромбоксан В2 и простагландины, а 90–95 % простагландинов группы Е и Fа инактивируются также в легких. На внутренней поверхности легочных капилляров локализуется большое количество ангиотензин-конвертирующего фермента, который катализирует превращение ангиотензина I в ангиотензин II. Легкие играют важную роль в регуляции агрегатного состояния крови благодаря своей способности синтезировать факторы свертывающей и противосвертывающей систем (тромбопластин, факторы VII, VIII, гепарин). Через легкие выделяются летучие химические соединения, образующиеся в ходе реакций обмена, происходящих как в легочной ткани, так и во всем организме человека. Так, например, ацетон выделяется в реакциях окисления жиров, аммиак и сероводород — при обмене аминокислот, предельные углеводороды — в ходе перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот. По изменению количества и соотношения выделяемых при дыхании веществ можно делать выводы об изменениях обмена веществ и наличии болезни.

С древних времен для диагностики заболеваний учитывался состав ароматических летучих веществ, выделяемых больным при дыхании и через кожу (т.е. запахи, исходящие от пациента). Продолжая традиции античной медицины, известный клиницист начала ХХ века М.Я. Мудров писал: «Обоняние твое да будет чувствительным не к масти благовоний для влас твоих, не к ароматам, из одежды твоей испаряемым, а к запертому и зловонному воздуху, окружающему больного, к заразительному его дыханию, поту и ко всем его извержениям» [1]. Анализ выделяемых человеком ароматических химических веществ имеет для диагностики столь важное значение, что многие запахи описаны как патогномоничные симптомы заболеваний: например, сладковатый «печеночный» запах (выделение метилмеркаптана — метаболита метионина) при печеночной коме, запах ацетона у больного в кето­ацидотической коме или запах аммиака при уремии.

Длительный период анализ ВВ носил субъективный и описательный характер, но с 1784 года в его изучении наступил новый этап — назовем его условно «параклинический» или «лабораторный». В этом году французский естествоиспытатель Антуан Лоран Лавуазье вместе с известным физиком и математиком Симоном Лапласом провели первое лабораторное исследование выдыхаемого воздуха у морских свинок. Они установили, что выдыхаемый воздух состоит из удушливой части, дающей угольную кислоту, и инертной части, которая выходит из легких без изменений. Эти части позже назвали углекислым газом и азотом [2, 3]. «Из всех явлений жизни нет более поразительного и заслуживающего внимания, чем дыхание», — пророчески писал  А.Л. Лавуазье.

Долгое время (ХVIII–ХIХ века) анализ ВВ проводился химическими методами. Концентрации веществ в ВВ низкие, поэтому для их выявления требовалось пропускание больших объемов воздуха через поглотители и растворы.

В середине XIX века немецкий врач А. Небельтау впервые использовал исследование ВВ для диагностики заболевания — в частности, нарушения обмена углеводов. Он разработал способ определения малых концентраций ацетона в ВВ. Больному предлагалось выдыхать в трубку, опущенную в раствор йодата натрия. Ацетон, содержащийся в воздухе, восстанавливал йод, при этом изменялся цвет раствора, по которому А. Небельтау довольно точно определял концентрацию ацетона [4].

В конце ХІХ — начале ХХ века количество исследований по изучению состава ВВ резко возросло, что было связано, прежде всего, с потребностями военно-промышленного комплекса. В 1914 году в Германии была спущена на воду первая подводная лодка «Лолиго», что стимулировало поиск новых способов получения искусственного воздуха для дыхания под водой. Фриц Хабер, разрабатывая химическое оружие (первые отравляющие газы) с осени 1914 г., параллельно разрабатывал защитную маску с фильтром. Первая газовая атака на фронтах Первой мировой войны 22 апреля 1915 года привела к изобретению в том же году противогаза. Развитие авиации и артиллерии сопровождалось строительством бомбоубежищ с принудительной вентиляцией. В дальнейшем изобретение ядерного оружия стимулировало проектировку бункеров для длительного пребывания в условиях ядерной зимы, а развитие космической науки требовало создания новых поколений систем жизнеобеспечения с искусственной атмосферой. Все эти задачи по разработке технических устройств, обеспечивающих нормальное дыхание в замкнутых пространствах, могли быть решены только при условии изучения состава вдыхаемого и выдыхаемого воздуха. Это та ситуация, когда «не было бы счастья, да несчастье помогло». Помимо углекислого газа, кислорода и азота, в ВВ были обнаружены пары воды, ацетон, этан, аммиак, сероводород, окись углерода и некоторые другие вещества. Anstie в 1874 г. выделил этанол в ВВ — этот метод и сегодня используется в дыхательном тесте на алкоголь [5].

Но качественный прорыв в изучении состава ВВ был сделан только в начале ХХ века, когда начали применяться масс-спектрография (МС) (Томпсон, 1912) и хроматография. Эти аналитические методы позволяли определять вещества, находящиеся в низких концентрациях, и не требовали больших объемов воздуха для выполнения анализа. Хроматография была впервые применена русским ученым-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году, но метод был незаслуженно забыт и практически не развивался до 1930-х годов. Возрождение хроматографии связано с именами английских ученых Арчера Мартина и Ричарда Синга, которые в 1941 г. разработали метод распределительной хроматографии, за что им в 1952 году была присуждена Нобелевская премия в области химии [6]. С середины XX века и до наших дней хроматография и масс-спектрография являются одними из наиболее широко применяемых аналитических методов для изучения ВВ. Этими методами в ВВ было определено около 400 летучих метаболитов, многие из которых используются как маркеры воспаления, определены их специфичность и чувствительность для диагностики многих заболеваний. Описание веществ, выявленных в ВВ при различных нозологических формах, в данной статье нецелесообразно, т.к. даже их простое перечисление займет многие страницы. Применительно к анализу летучих веществ ВВ необходимо сделать акцент на трех моментах.

Во-первых, анализ летучих веществ ВВ уже «вышел» из лабораторий и сегодня имеет не только научный и теоретический интерес, но и сугубо практическое значение. Примером являются капнографы (приборы, регистрирующие уровень углекислого газа). С 1943 г. (когда Luft создал первый прибор для регистрации СО2) капнограф — обязательный компонент аппаратов ИВЛ и анестезиологической аппаратуры. Другой пример — определение оксида азота (NO). Впервые его содержание в ВВ было измерено в 1991 г. L. Gustafsson и соавт. у кроликов, морских свинок и людей [7]. В последующем потребовалась одна пятилетка, чтобы значение этого вещества как маркера воспаления было доказано. В 1996 г. группой ведущих исследователей созданы единые рекомендации по стандартизации измерений и оценки выдыхаемого NO — Exhaled and nasal nitric oxide measurements: recommendations [8]. А в 2003 г. получено разрешение FDA и начато промышленное производство детекторов NO [9]. В развитых странах определение оксида азота в ВВ широко применяется в рутинной практике пульмонологами, аллергологами как маркер воспаления дыхательных путей у стероид-наивных пациентов и для оценки эффективности противовоспалительной топической терапии у больных с хроническими обструктивными заболеваниями легких [10–12].

Во-вторых, наибольшая диагностическая значимость анализа ВВ отмечена при заболеваниях органов дыхания — описаны достоверные изменения состава ВВ при бронхиальной астме, ОРВИ, бронхоэктатической болезни, фиброзирующем альвеолите, туберкулезе, реакции отторжения легочного трансплантата, саркоидозе, хроническом бронхите, поражении легких при системной красной волчанке, аллергическом рините и др. [13].

В-третьих, при некоторых нозологических формах анализ ВВ позволяет выявить патологию на той стадии развития, когда другие методы диагностики малочувствительны, неспецифичны и неинформативны. Например, обнаружение алканов и монометилированных алканов в ВВ позволяет диагностировать рак легких на ранних стадиях (Gordon et al., 1985) [14], в то время как стандартные скрининг-исследования при опухоли легких (рентгенография и цитология мокроты) еще не информативны [15]. Исследование данной проблемы было продолжено Phillips et al., в 1999 г. ими определено в ВВ 22 летучих органических вещества (преимущественно алканы и производные бензола), содержание которых было достоверно выше у больных с опухолью легких [16]. Ученые из Италии (Diana Poli et al., 2005) показали возможность использования стиролов (с молекулярной массой 10–12 M) и изопренов (10–9 M) в ВВ как биомаркеров опухолевого процесса — диагноз был корректно установлен у 80 % больных [17].

Таким образом, исследование ВВ продолжается достаточно активно по многим направлениям, и изучение литературы по данной проблеме вселяет в нас уверенность, что в будущем анализ ВВ для диагностики заболеваний станет столь же рутинным методом, как контроль уровня алкоголя в ВВ у водителя транспортного средства работником ГАИ.

Новый этап изучения свойств ВВ начался в конце 70-х годов прошлого века — нобелевский лауреат Linus Pauling (Лайнус Полинг) предложил анализировать конденсат ВВ (КВВ). Используя методы газовой и жидкостной хроматографии, ему удалось идентифицировать до 250 веществ [18], а современные методики позволяют определить до 1000 (!) субстанций в КВВ [19].

С физической точки зрения ВВ представляет собой аэрозоль, состоящий из газообразной среды и взвешенных в ней жидких частиц. ВВ насыщен водяными парами, количество которых составляет примерно 7 мл/кг массы тела в сутки. Взрослый человек выделяет через легкие около 400 мл воды в сутки, но суммарный объем экспиратов зависит от многих внешних (влажность, давление окружающей среды) и внутренних (состояние организма) факторов. Так, при обструктивных заболеваниях легких (бронхиальная астма, хронический обструктивный бронхит) объем экспиратов уменьшается, а при остром бронхите, пневмонии — увеличивается; гидробалластная функция легких уменьшается с возрастом — на 20 % каждые 10 лет, зависит от физической нагрузки и т.д. [20, 21]. Увлажнение ВВ также определяется бронхиальным кровообращением [22]. Водяные пары служат переносчиками многих летучих и нелетучих соединений посредством растворения молекул (согласно коэффициентам растворения) и образования новых химических веществ внутри аэрозольной частицы [23].

Известны два основных метода формирования аэрозольных частиц:

1. Конденсационный — от малого к большому — образование капель жидкости из молекул перенасыщенного пара.

2. Диспергационный — от большого к малому — измельчение бронхоальвеолярной жидкости, выстилающей респираторный тракт, при турбулентном потоке воздуха в дыхательных путях [24, 25].

Средний диаметр аэрозольных частиц в норме при нормальном дыхании у взрослого человека составляет 0,3 мкм, а количество — 0,1–4 частицы в 1 см2 [26]. При охлаждении воздуха водяные пары и содержащиеся в них вещества конденсируются, что делает возможным их количественный анализ.

Таким образом, диагностические возможности исследования КВВ базируются на гипотезе, что изменения концентрации химических веществ в КВВ, сыворотке крови, легочной ткани и бронхоальвеолярной лаважной жидкости однонаправлены [19, 27].

Для получения КВВ используют приборы как серийного производства (EcoScreen® — Jaeger Tonnies Hoechberg, Германия; R Tube® — Respiratory Research, Inc., США), так и самодельные. Принцип действия всех устройств единый: пациент совершает форсированные выдохи в емкость (сосуд, колбу, трубку), в которой водяные пары, содержащиеся в воздухе, конденсируются при охлаждении. Охлаждение осуществляется жидким или сухим льдом, реже — жидким азотом. Для улучшения конденсации водяных паров в емкости для сбора КВВ создается турбулентный поток воздуха (изогнутая трубка, изменение диаметров сосуда). Подобные устройства позволяют собрать у детей старшего возраста и взрослых до 5 мл конденсата за 10–15 мин дыхания. На кафедре пропедевтики педиатрии № 2 ХНМУ (В.А. Клименко, Д.Н. Криворотько, 2009) создано устройство для получения КВВ у детей раннего возраста (заявка подана, № приоритета U 2010 05878 от 10 мая 2010 г.). Устройство состоит из стеклянной изогнутой трубки, помещенной в сосуд с жидким льдом, системы клапанов (вдоха/выдоха) и маски для дыхания. Для сбора конденсата не требуется активного сознательного участия пациента, что делает возможным применение методики с периода новорожденности. За 45 мин спокойного дыхания у новорожденных с пневмонией удается получить 0,1–0,3 мл конденсата.

Большинство биологически активных веществ могут быть исследованы в конденсате, собранном при помощи самодельных приборов. Исключение составляют лейкотриены — учитывая их быстрый метаболизм и нестабильность, они могут быть определены только в замороженных образцах, полученных приборами серийного производства. Например, в устройстве EcoScreen создается температура до –10 °С, что обеспечивает быструю заморозку конденсата.

На состав КВВ может влиять материал, из которого изготовлен контейнер. Так, при исследовании производных липидов прибор должен быть изготовлен из полипропилена и рекомендуется избегать контакта КВВ с полистиреном, который может абсорбировать липиды, влияя на точность измерений [29, 30].

Какие биомаркеры сегодня определены в КВВ? Наиболее полный ответ на этот вопрос содержится в обзоре, выполненном Montuschi Paolo (отделение фармакологии медицинского факультета Католического университета Святого Сердца, Рим, Италия). Обзор опубликован в 2007 году в журнале Therapeutic Advances in Respiratory Disease [31], данные представлены в  табл. 1.

Таким образом, конденсат выдыхаемого воздуха является биологической средой, по изменению состава которой можно судить о морфофункциональном состоянии, прежде всего респираторного тракта, а также других систем организма. Сбор и исследование конденсата представляют собой новое перспективное направление современных научных исследований.