Журнал «Травма» Том 9, №3, 2008

Остеопрогениторные популяции мезенхимальных стволовых клеток (МСК), обладают характерным антигенным профайлом, и, в общем, разделяют антигены с остальными костномозговыми клеточными популяциями. Некоторые из детектируемых поверхностных маркеров конститутивно экспрессируются клетками кости. Другие эпигенетически регулируются различными факторами или цитокинами, выделяемыми в экстрацеллюлярный матрикс (ЭЦМ) теми или иными клеточными популяциями, которые слаженно и в тесной кооперации друг с другом участвуют в процессах физиологической и репаративной регенерации кости. Это клетки лимфо-миелоидного и моноцитарно-макрофагального ряда, зрелые остеокласты и незрелые клетки предшественники остеобластов [15].

Под МСК в данной статье понимаются культивированные клеточные мезенхимальные линии, полученные как из стромы костного мозга, так и из других тканей, и соответствующие трем минимальным идентификационным критериям, предложенным в 2006 г. Комитетом по мезенхимальным и тканевым стволовым клеткам при Международном обществе по клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy - ISCT) [6]: 1) адгезия к пластику при стандартных условиях культивирования; 2) специфическая экспрессия поверхностных клеточных антигенов (позитивная экспрессия CD105, CD73, CD90 и негативная CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79α или CD19, HLA-DR); 3) мультилинеарный потенциал к in vitro дифференцировке в остеобласты, адипоциты и хондробласты.

Целью настоящих исследований является определение функционально-фенотипических характеристик некоммитированных и коммитированных по остеогенному типу МСК костного мозга человека в условиях клеточной культуры. В фенотипическом плане изучается и сравнивается набор поверхностных антигенов межклеточной и клеточно-матриксной адгезии, активации и костимуляции иммунного ответа, МНС I и II классов, а также маркеров гемопоэтических стволовых клеток в обеих линиях МСК.

Материал и методы

МСК изолировали по общепринятой методике [11] из аспирата костного мозга, забранного на гепарине, при пунктировании грудины или гребня подвздошной кости у пациентов травматологического профиля. Среднее количество аспирата составляло 20 мл от одного больного. Мононуклеарную фракцию аспирата высевали на проколлагененные пластиковые флаконы площадью 75 см2 (Corning, США) и культивировали в ростовой среде DMEM/F12 (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия) и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов (Sigma, США) в СО2-инкубаторе (Jouan, Франция) при 37°С и 5% атмосфере СО2. Пассирование культур производили 0,25% раствором трипсина и ЭДТА (Биолот, Россия) в соотношении 1:5. Остеоиндукцию линий МСК производили путем внесения в выше указанную ростовую среду остеогенной добавки: 0,1 μМ дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma, США). Окраску культур на щелочную фосфатазу (ЩФ) проводили иммуноцитохимическим методом с применением субстрата BCIP/NBT Liquid Substrate System (Sigma, США) согласно инструкции. Иммуномаркирование клеточных культур МСК 1-4 пассажей производили с помощью моноклональных антител, МКА, (BD Biosciences, США) модифицированным методом прямой и непрямой флуоресцентной окраски для флуоресцентной микроскопии, защищенным патентом Украины [1]. Визуализацию и фотодокументирование культур осуществляли посредством инвертированного микроскопа Leica DMIL, рабочей станции по обработке изображений Leica QWin500 Standart и видеокамеры Sanyo TK-C1380, а также системы для флуоресцентной микроскопии и обработки изображения Leica DMLS - DC-IM-50 (Германия).

Полученные данные были выражены как среднее значение со стандартной ошибкой среднего и подвергнуты статистическому анализу.

Результаты и обсуждение

Продукция щелочной фосфатазы остеоиндуцированными линиями МСК

ЩФ является эктозимом, заякоренным в клеточной мембране. Ее функция состоит в гидролизе органических фосфорных соединений, например моноэфиров фосфорных кислот (β-глицерофосфат), в неорганический фосфат-ион, который в свою очередь вносит основной вклад в процесс минерализации матрикса кости [4, 9, 17]. В случае остеогенеза речь идет о костном изоферменте ЩФ – остазе. При обработке конфлуентных культур глюкокортикоидом дексаметазоном МСК начинают секрецию ЩФ. Как видно из графика, представленного на рисунке 1, синтез остазы начинается примерно с седьмых суток остеогенной индукции. Резкий скачок в активной секреции ЩФ происходит с седьмых по десятые сутки индукции. Так, для средне статистической остеогенной линии (n=14), состоящей из 4-х культур, на 10 сутки реакция на ЩФ становилась позитивной в 3,1 культур из 4-х, а начиная с 13 суток остеоиндукции и по 19 сутки активность ЩФ оставалась на стабильно высоком уровне в 3,6 культур.

В процессе индукции МСК претерпевают определенные морфологические изменения. Так, на 7 сутки индукции, в культуре наблюдаются веретеновидные фибробластоидные мало дифференцированные клетки с включением единичных более крупных, распластанных и продуцирующих ЩФ клеток (рис. 2а). Но уже с 13 суток ЩФ активно вырабатывается практически всеми клетками индуцированных культур (рис. 2.б-г), и отчетливо прослеживаются изменения в морфологии клеток и структуре монослоя. С увеличением сроков индукции монослойные некоммитированные культуры со специфическим взаимно параллельным расположением веретеновидных клеток (рис. 2а), постепенно образовывали стратифицированные плотные полусферические скопления и активно секретировали ЩФ (рис. 2.г). Происходящая в процессе индукции перестройка пространственной архитектоники монослоя МСК, напоминает по своей природе формирование остеогенных островков, характерных для процесса прямого остеогенеза. При этом, в ходе почти трехнедельной индукции, ЩФ-позитивные МСК приобретали распластанный вид и округло-многоугольную форму с выраженными выростами цитоплазмы (рис. 2.в).

Фенотипическая характеристика культивированных некоммитрованных и коммитированных МСК. В таблице представлены данные по фенотипированию некомитированных и комитированных по остеогенному пути линий МСК. При изучении и сравнении антигенов клеточной поверхности использовалась бальная система и статистический непараметрический Н-критерий Краскелла-Уоллиса. Так, 1 бал соответствовал единичным позитивным клеткам в поле зрения; 2 бала – количество позитивных клеток составляло до 25%; 3 бала – до 50%; 4 бала – до 75% и 5 балов – до 100%. Для удобства сравнения маркеров, антигены были разбиты на некие общие группы, представленные в таблице. Прежде всего, необходимо отметить отсутствие экспрессии поверхностных гемопоэтических маркеров (CD34, CD45, CD14, CD19) в обеих группах МСК. Это говорит об однородности культивированных популяций МСК и отсутствии в них ранних предшественников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Полученные результаты целиком согласуются с предложенными Комитетом по мезенхимальным и тканевым стволовым клеткам минимальными критериями идентификации МСК [6]. Относительно экспрессии молекул I и II классов главного комплекса гистосовместимости человека, HLA A, B, C и HLA-DR соответственно, то, как видно из таблицы, достоверную детекцию HLA-DR выявили в группе коммитированных МСК 4 пассажа, но уровень этой экспрессии был весьма слабым. То есть, приведенные результаты свидетельствуют о низкой вероятности трансплантационных реакций, направленных против биотехнологически размноженных МСК человека в обеих группах. При изучении антигенного профиля в группе маркеров межклеточной адгезии и интегриновых цепей – маркеров клеточно-матриксной адгезии, было отмечено, что уровень экспрессии этих молекул обеими группами МСК в процессе культивирования оставался на стабильном среднем и высоком уровне. На клетках некоммитированой и остеоиндуцированной группы МСК определялись рецепторы (CD29, CD49b и CD49c) к молекулам костного матрикса – ламинину, коллагену, фибронектину (α2β1, α3β1) и гиалуроновой кислоте (CD44) (рис. 3).

CD105 экспрессировался в одинаковой степени как на некоммитированных, так и на коммитированных МСК. Данный антиген играет ключевую роль в процессах ангиогенеза и гемопоэза. Он широко экспрессируется на поверхности эндотелиоцитов и является частью рецепторного комплекса TGFβ и участвует в связывании TGFβ1, TGFβ3, BMP-2 и BMP-7. Иными словами, CD105 может косвенно участвовать в депонировании костных матриксных белков при реорганизации костного регенерата [5]. Прослеживается и его регуляторная роль в процессах клеточной миграции МСК в ране [5].

МСК активно экспрессируют молекулы активации и костимуляции иммунного ответа, которые относятся, по большому счету, к группе антигенов межклеточного взаимодействия. Наблюдался средний уровень экспрессии обеими группами CD58 – основного антигена функциональной активности лимфоцитов, участвующего и в воспалительном процессе, и высокий уровень экспрессии CD166, ответственного за активацию лимфоцитов по гомо- или гетерофильному механизму (рис. 4).

CD73 является маркером созревания лимфоцитов и участвует в таких иммунологических феноменах, как активация, пролиферация и адгезия лимфоцитов к эндотелию, и, по последним данным, опосредует связывание лимфоцитов с культивированными эндотелиоцитами, а также является вспомогательной активационной молекулой Т-лимфоцитов [2, 3]. Таким образом, роль линий МСК, посредством экспрессии CD73, также может потенциально сводиться к активации Т-клеточного звена иммунного ответа в костной ране.

Поскольку лигандом CD90 является пан-лейкоцитарный антиген CD45, то можно выдвинуть предположение о потенциальной роли Thy-1, а в целом и самих линий МСК, в процессах иммунной регуляции воспалительной фазы репаративной регенерации костной ткани.

Кроме того, CD105, CD90 и CD73 были взяты и в качестве позитивного критерия идентификации культивированных линий МСК человека [6]. Как видно из таблицы, уровень их экспрессии не самый высокий, но стабильный, независимо от длительности культивирования или остеогенной индукции МСК линий.

В 2000 году группа авторов из Великобритании под руководством R. Grimer [7] предложила молекулу CD56 (NCAM - neural cell adhesіon molecule), антиген натуральных киллеров, рассматривать в качестве нового остеобластного маркера. В их иммуногистохимических исследованиях этот антиген активно экспрессировался остеобластами, клетками периоста и МСК в зонах активного формирования кости in vivo, а также неопластическими остеобластами. При этом NCAM-молекула не экспрессировалась остеоцитами. Как видно из таблицы, уровень экспрессии CD56 некоммитированными клетками был выше среднего, а остеоиндуцированные клетки достоверно выявили отсутствие экспрессии данного маркера.

CD54 способен активировать Т- и В-лимфоциты, моноциты и эндотелиальные клетки [8]. Его экспрессия находится на стабильном среднем уровне в обеих группах МСК. Видимо, данный антиген свидетельствует о вовлечении МСК в процессы васкуляризации и привлечения предшественников остеокластов в область резорбции и заживления костной ткани, а также выполнения определенных иммунорегуляторных функций.

CD62L действует как хоуминговый рецептор для лейкоцитов при проникновении последних во вторичные лимфоидные ткани посредством облегчения адгезии лимфоцитов к адрессинам, экспрессируемым на активированном эндотелии высоких венул [13]. Его экспрессия обеими группами МСК была ниже среднего уровня.

Остеопонтин (ОП) взят в качестве маркера эффективности остеогенной дифференциации культивированных МСК, наряду со ЩФ. Как видно из таблицы, некоммитированные МСК экспрессировали его на уровне единичных клеток во всех пассажах (<2%), в то время как коммитированная группа достоверно экспрессировала его на уровне приблизительно 95% (рис. 5). Это важный фактор, регулирующий иммунный ответ и воспаление. Его экспрессия инициируется, как в остеобластах и остеокластах, так и в активированных Т-клетках, макрофагах и натуральных киллерах [10, 16]. ОП также стимулирует привлечение макрофагов и лимфоцитов в участок повреждения ткани и регулирует их активность [18]. ОП является незаменимым фактором-посредником активации и адгезии остеокластов к гидроксиапатиту минеральной фазы костного матрикса. Именно этот протеин через витронектиновый рецептор «заякоривает» остеокласты в участках активной костной резорбции [18], а также участвует в активной продукции остеобластами остеоидов [12, 18]. Экспрессия ОП, вероятнее всего, является и частью быстрого Т-лимфоцит-зависимого ответа при бактериальной инфекции, что может предварять классические формы Т-клеточного иммунитета [14].