Журнал «Здоровье ребенка» 1 (36) 2012

Введение

Активные метаболиты витамина D в организме человека оказывают плейотропное действие на многочисленные физиологические процессы, в том числе и на реакцию защитных неспецифических и адаптивных механизмов, предопределяя активность эрадикации инфекционного возбудителя и характер воспалительного, аутоиммунного процессов [1, 6, 18]. В последнее время установлено, что уровень обеспечения витамином D высоко ассоциирован с риском развития инфекционных (острые респираторные вирусные инфекции, туберкулез), хронических воспалительных (болезнь Крона), аллергических (бронхиальная астма), аутоиммунных (рассеянный склероз, сахарный диабет 1-го типа, псориаз), сердечно-сосудистых (артериальная гипертензия, сердечная недостаточность) и различных неопластических заболеваний [5, 29, 33, 36,37, 41].

На протяжении многих лет состояние обеспечения витамином D определяли по уровню концентрации кальцитриола в сыворотке крови, однако в последнее время изменилось понимание дефиниции D-витаминного статуса. Истоки новой парадигмы статуса обеспеченности витамином D восходят к исследованиям, результаты которых показали, что уровень концентрации паратирина обратно пропорционально коррелирует с содержанием не кальцитриола (1,25-дигидроксихолекальциферола — 1,25(OH)₂D), а 25-гидроксихолекальциферола (25-OH-D₃) в сыворотке крови. В связи с этим было принято, что дефицит витамина D — это состояние, при котором уровень концентрации 25-OH-D₃ в сыворотке крови составляет менее 75 нмоль/л (признаки рахитического поражения костной ткани наблюдаются, если уровень содержания 25-OH-D₃ ниже 20 нмоль/л) [24]. Популяционные исследования позволили установить, что распространенность недостаточности витамина D достигает эпидемического уровня. В настоящее время среди человеческой популяции не менее одного миллиарда людей находятся в D-дефицитном состоянии. Кроме того, за последние десять лет средний уровень концентрации 25-OH-D₃ в сыворотке крови у людей снизился почти на 20 % [15]. Общая схема метаболизма витамина D и его роль в кальциево-фосфорном обмене представлены на рис. 1.

Как видим, под влиянием солнечных ультрафиолетовых лучей длиной 290–315 нм 7-дегидрохолестерин в мальпигиевом и базальном слоях кожи превращается в провитамин D₃, из которого быстро образуется витамин D₃. Провитамин D₃ и витамин D₃ инактивируются при чрезмерной дозе ультрафиолетового облучения. Витамин D₃ (холекальциферол) и витамин D₂ (эргокальциферол) продуктов питания, всасываясь в пищеварительном тракте, в комплексе с хиломикронами транспортируются по лимфатическим сосудам в кровеносное русло. В сыворотке крови витамин D комплексируется с витамин-D-связывающим протеином (DBP) и транспортируется в печень, где в купферовских клетках под воздействием мембранного фермента семейства цитохрома P⁴⁵⁰ 25-гидроксилазы (CYP27A1) превращается в 25-гидроксихолекальциферол. 25-OH-D₃ является основной циркулирующей формой витамина D, уровень концентрации которой используется для определения статуса обеспечения витамином D. Оптимальной концентрацией считают 75–150 нмоль/л (30–60 нг/мл). Витамин D (D₂ или D₃) может аккумулироваться в адипоцитах, образуя депо запаса, и высвобождаться по мере необходимости. Комплекс 25-OH-D₃/DBP взаимодействует с эндоцитозными рецепторами клеток проксимальных канальцев — мегалином и кубилином, которые реабсорбируют 25-OH-D₃ из клубочкового фильтрата. Форма 25-OH-D₃ витамина D является биологически малоактивной, она гидроксилируется в почках при помощи митохондриального фермента семейства цитохрома P⁴⁵⁰ 1a-гидроксилазы (CYP27B1) до биологически высокоактивного метаболита кальцитриола (1,25(OH)₂D). Основная доля 1,25(OH)₂D в организме человека синтезируется в первичных канальцах почек, но некоторая часть синтезируется в разнообразных типах клеток, которые экспрессируют CYP27B1. Почечная продукция 1,25(OH)₂D происходит в ответ на снижение уровня ионов Са²⁺ в сыворотке крови. Снижение содержания ионов Са²⁺ в сыворотке крови стимулирует и продукцию паратирина паращитовидными железами. Паратирин индуцирует экспрессию CYP27B1 в клетках первичных почечных канальцев. Активность продукции кальцитриола в основном зависит от уровня содержания ионов кальция и фосфатов, фактора роста фибробластов 23 (FGF-23) в сыворотке крови. Кальцитриол, попадая в ядро клеток кальциевых каналов, взаимодействует с гетеродимером, который образован рецептором витамина-D (vitamin D receptor — VDR) и х-рецептором ретиноевой кислоты (retinoic acid x-receptor — RXR). Образование комплекса 1,25(OH)₂D/VDR/RXR обусловливает взаимодействие VDR с витамин D-регуляторными элементами промоторных областей целевых генов, что приводит к усилению их транскрипции, в частности генов, влияющих на обмен кальция, — гена переходного рецепторного потенциального катионного канала, подсемейства V, 6-го члена (transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 6 — TRPV6), гена кальций-связывающего белка (calcium-binding protein — CaBP) кальбиндина 9K. Продукты данных генов обеспечивают увеличение абсорбции ионов Са²⁺ в тонком кишечнике. Достаточный уровень концентрации ионов Са²⁺ и HPO₄^-2 в сыворотке крови обеспечивает адекватную минерализацию костной ткани. В остеобластах 1,25(OH)₂D индуцирует экспрессию трансмембранного лиганда рецептора активатора ядерного фактора kB (receptor activator of nuclear factor-kB ligand — RANKL). Остеобластный RANKL, взаимодействуя с рецептором RANK преостеокластов, индуцирует их матурацию в зрелые остеокласты. Зрелые остеокласты участвуют в резорбции Са²⁺ и фосфора из костной ткани для поддержания их концентрации в сыворотке крови. Увеличение продукции 1,25(OH)₂D происходит до некоторого метаболического момента. При достижении определенного уровня концентрации 1,25(OH)₂D в сыворотке крови он по принципу обратной связи ингибирует собственную продукцию. В основе данной отрицательной обратной связи лежит подавление VDR экспрессии гена CYP27B1. Кроме того, 1,25(OH)₂D индуцирует продукцию остеоцитами FGF-23, который ингибирует синтез паратирина. Под влиянием 1,25(OH)₂D увеличивается экспрессия 24-гидроксилазы, превращающей кальцитриол в биологически неактивную кальцитроевую кислоту, которая выделяется с желчью.

Влияние витамина D на иммунную систему

Витамин D оказывает влияние практически на все механизмы неспецифической защиты от инфекционных агентов и систему иммунного специфического ответа. Кальцитриол непосредственно модулирует пролиферацию Т-лимфоцитов, подавляет развитие Th₁₇-клеток, замедляет дифференцировку В-клеток-предшественников в плазматические клетки, ингибирует продукцию Th₁-ассоциированных цитокинов и костимулирующих молекул (CD40, CD80 и CD86), стимулирует продукцию Th₂-ассоциированных цитокинов и др. (рис. 2) [16].

Механизмы витамин-D-зависимой продукции антимикробных пептидов

На протяжении нескольких лет считалось, что важнейшими эффектами действия витамина D являются индукция дифференцировки моноцитов, стимуляция процесса фагоцитоза у макрофагов и усиление продукции и экспрессии антимикробных пептидов (АМП). Однако в последующем были представлены доказательства зависимости функционирования и других клеток от обеспечения витамином D. Оказалось, что сочетанная экспрессия фактора транскрипции семейства стероид/гормональных рецепторов VDR и митохондриального фермента семейства цитохрома P⁴⁵⁰ 1a-гидроксилазы отмечается в таких клетках, как моноциты, дендритные клетки, лимфоциты, нейтрофилы, эпителиоциты респираторного и пищеварительного тракта, клетки децидуальной оболочки и трофобласта. Экстраренальная продукция кальцитриола происходит в костной ткани, эпителии кожи, слизистых оболочек легких и толстого кишечника, паращитовидных железах. А экспрессия VDR характерна для большинства клеток иммунной системы [3, 16, 20, 21, 44].

Активация экстраренальной экспрессии 1a-гидроксилазы обеспечивает синтез кальцитриола, который, взаимодействуя с VDR, индуцирует продукцию АМП [16].

Индукция экстраренальной экспрессии 1a-гидроксилазы ассоциирована с возбуждением образ-распознающих рецепторов (TLR, NLR) и с действием TGF-b₁, по крайней мере в кожных покровах.

Группа исследователей под руководством Robert L. Modlin [40] описала витамин-D-зависимый путь TLR2/1-ассоциированного внутриклеточного пути возбуждения синтеза антимикробных пептидов в человеческих моноцитах, продемонстрировав, что эффекты активации TLR1/2 зависят от уровня экспрессии VDR и 1a-гидроксилазы. Авторы показали, что наличие витамина D способствует продукции антимикробного пептида кателицидина (LL-37) при возбуждении гетеродимера TLR1/2 липопептидом 19 кДа клеточной мембраны Mycobacterium tuberculosis. Витамин D индуцирует продукцию АМП и при возбуждении TLR4 липополисахаридом грамотрицательных бактерий [9]. Витамин D и активность TLR находятся в достаточно сложных взаимоотношениях. Так, кальцитриол в кератиноцитах усиливает экспрессию TLR2 [27], а в моноцитах ингибирует экспрессию TLR2 и TLR4 [43].

В последующих исследованиях было установлено, что при активации TLR кальцитриол индуцирует экспрессию b-дефензинов и кателицидина (LL-37) не только в моноцитах, но и в нейтрофилах и кератиноцитах. Причем в клетках иммунной системы повышение экспрессии АМП, наблюдаемое при стимуляции TLR в присутствии витамина D, сопровождается одновременной ингибицией продукции провоспалительных цитокинов IL-1b, IL-12 и TNF-a [7].

По всей вероятности, TLR-ассоциированная экспрессия 1a-гидроксилазы связана с возбуждением различных внутриклеточных сигнальных каскадов. По мнению Stephan R. Krutzik и соавт. [26], индукция экспрессии гена 1a-гидроксилазы CYP27B1 не связана с активацией TLR-ассоциирован­ного сигнального пути, а обусловлена действием IL-15, продукция которого зависит от возбуждения TLR2/1. IL-15 также усиливает экспрессию VDR. Авторы считают, что IL-15 способствует не только биоконверсии метаболитов витамина D, но и проявлению его рецепторзависимого действия на целевые гены. В то время как при активации TLR4 индукция экспрессии CYP27B1 связана с TLR4-ассоциированными сигнальными компонентами с возбуждением JAK, MAPK и фактором транскрипции NF-kB [19].

Kristina Edfeldt и соавт. [38] установили, что Th₁- и Th₂-ассоциированные цитокины дифференцированно влияют на продукцию АМП. Основными цитокинами, влияющими на TLR2/1-ассоциированную индукцию экспрессии антимикробных пептидов кателицидина (LL-37) и HBD-2, являются IFN-g и IL-4. Известно, что в ответ на стимуляцию IFN-g нормальные человеческие макрофаги синтезируют 1,25(OH)₂D, и при достаточной экспрессии VDR возникает активация моноцитов и макрофагов. Возбуждение TLR2/1 и IFN-g усиливает экспрессию гена 1a-гидроксилазы CYP27B1 в моноцитах, что приводит к превращению 25-OH-D₃ в активный метаболит 1,25(OH)₂D, который, связываясь с VDR, индуцирует транскрипцию генов DEFB4А и CAMP, кодирующий кателицидин (LL-37). В отличие от IFN-g IL-4 индуцирует экспрессию гена 24-гидроксилазы CYP24A1, что приводит к синтезу неактивных метаболитов — 24,25 D₃ — витамина D и подавлению аутофагии. Также было продемонстрировано, что IFN-g, IL-1b, IL-6, IL-17, IL-22 и TNF-a усиливают, а IL-10, IL-4 и IL-13 ингибируют экспрессию HBD‑2 в кератиноцитах [25].

Кальцитриол, образованный непосредственно в CYP27B1-экспрессирующих клетках, в цитоплазме клетки взаимодействует с обладающим высоким аффинитетом к 1,25(OH)₂D лиганд-связывающим доменом фактора транскрипции VDR, который в зависимости от типа клеток находится в виде гомодимеров или гетеродимеров. Ядерный рецептор VDR может образовывать гетеродимеры с тремя типами ретиноидных рецепторов — RXRa, RXRb, RXRg. Взаимодействие 1,25(OH)₂D с гетеродимером VDR/RXR приводит к образованию комплекса 1,25(OH)₂D/VDR/RXR, в связи с чем рекрутируются моторные белки и комплекс 1,25(OH)₂D/VDR/RXR быстро перемещается в цитоплазме вдоль микротрубочек к ядру клетки. Взаимодействие 1,25(OH)₂D с VDR также обусловливает конформационные изменения трехмерной структуры молекулы VDR, которые открывают последовательности ядерного импорта, которые могут взаимодействовать с a-импортинами пор ядерной мембраны. Кальцитриол стабилизирует связь VDR с a-импортинами, способствуя перемещению комплекса 1,25(OH)₂D/VDR/RXR в ядро клетки [11, 46].

Импортированный в ядро клетки 1,25(OH)₂D/VDR/RXR взаимодействует с витамин-D-ре­гуля­тор­ными элементами (vitamin D response element — VDRE), состоящими из повторяющихся мотивов PuG(G/T)TCA, промоторных областей целевых генов. Рецептор витамина D регулирует транскрипцию целевых генов по крайней мере тремя различными способами. Во-первых, он усиливает экспрессию генов, взаимодействуя с положительными витамин-D-регуляторными элементами; во-вторых, ингибирует экспрессию генов, взаимодействуя с отрицательными витамин-D-регуляторными элементами, и, в-третьих, ингибирует экспрессию факторов транскрипции, таких как NFAT и NF-kB, а также их взаимодействие с энхансерами [31].

Взаимодействие комплекса 1,25(OH)₂D/VDR/RXR с положительными VDRE приводит к продукции определенных протеинов, в том числе и некоторых АМП (рис. 3) [28].

VDRE промоторов генов DEF4A и CAMP находится перед соответствующими сайтами инициации транскрипции (рис. 4) [9].

Взаимодействие VDR с VDRE-промотором генов DEF4A и CAMP обусловливает индукцию синтеза HBD-2 и кателицидина (LL-37) соответственно. Промотор гена DEFB4А содержит один VDRE и два NF-kB-регуляторных элемента, а промотор CAMP гена содержит три VDRE и не имеет ни одного NF-kB-регуляторного элемента [8]. Кальцитриол индуцирует экспрессию и HBD-3 [34]. Интересно, что наличие VDRE в промоторной области гена CAMP характерно только для высших приматов (человек и шимпанзе), VDRE отсутствует в промоторной области гена CAMP у других млекопитающих, в частности мышей, крыс и собак [17]. По всей вероятности, витамин-D-зависимое регулирование неспецифических механизмов защиты является относительно недавним приобретением эволюционного развития. Adrian F. Gombart и соавт. [17] предполагают, что VDRE в промоторной области гена CAMP появился в качестве механизма, который усиливает неспецифическую систему противомикробной защиты организма. Об эффективности такого механизма свидетельствует тот факт, что у высших приматов, значительно более устойчивых к инфекционным заболеваниям, достоверно выше уровень концентрации 25-OH-D₃ в сыворотке крови, чем у людей.

Для экспрессии HBD-2, HBD-3 необходима конвергенция возбуждения TLR и влияния IL-1b [44], а в энтероцитах индукция их экспрессии может быть связана с активацией NLRC2 [10]. В процессе синтеза HBD-2, HBD-3, ассоциированного с образ-распознающими рецепторами возбуждения, участвуют p38, ERK, JNK, а кателицидина (LL-37) — исключительно р38 [34].

Несмотря на то что многочисленные типы клеток человеческого организма экспрессируют VDR и 1a-гидроксилазу, данные молекулярно-биологических исследований показывают, что VDR-опосредованная индукция АМП не является универсальной для всех типов клеток организма и в естественных условиях зависит от множества различных внешних и внутренних факторов. VDR-опосредованная индукция АМП является характерной особенностью миелоидных клеток, кератиноцитов, эпителиоцитов пищеварительного и респираторного трактов, трофобластов (рис. 5).

Эпителиоциты слизистой оболочки толстого кишечника (клеточная линия Caco-2), как и моноциты, активно участвуют в VDR-опосредованной индукции АМП. Витамин-D-зависимое регулирование продукции АМП в эпителиоцитах слизистой оболочки толстого кишечника, регулярно взаимодействующих с комменсальными кишечными бактериями, существенным образом отличается от VDR-опосредованной индукции АМП моноцитами, кератиноцитами и клетками плаценты [2]. Tian-Tian Wang и соавт. [10] продемонстрировали, что кальцитриол-ассоциированный сигнальный путь функционально связан с цитоплазматическим рецептором NLRC2. Возбуждение NLRC2 мурамилдипептидом при адекватном обеспечении кальцитриолом способствует увеличению практически в два раза продукции HBD-2 и кателицидина (LL-37) эпителиоцитами слизистой оболочки толстого кишечника. Авторы считают, что дефицит витамина D может быть одной из основных причин развития болезни Крона.

Эпидермальные кератиноциты могут экспрессировать дефензины и кателицидин (LL-37) в ответ на возбуждение TLR при достаточной концентрации витамина D. Однако у кератиноцитов в связи с низким уровнем экспрессии TLR базальная экспрессия 1a-гидроксилазы может стимулироваться TGF-b₁. Экспрессия TGF-b₁ кератиноцитами является характерной особенностью реакции кожных покровов на воздействие повреждающего экзогенного фактора, и, следовательно, витамин-D-опосредованная экспрессия АМП может быть также частью механизмов репарации ткани. В отличие от моноцитов, эпителиоцитов толстого кишечника и кератиноцитов клетки плаценты конститутивно синтезируют кальцитриол. В клетках трофобласта, плаценты, децидуальной оболочки характерна высокая экспрессия VDR и 1a-гидроксилазы. По всей вероятности, высокий уровень конститутивной экспрессии 1a-гидроксилазы в клетках плаценты и децидуальной оболочки обеспечивает антибактериальный компонент фетоплацентарного барьера [2, 42].

Клиническое значение витамин-D-зависимой продукции антимикробных пептидов

За последние три года (2009–2011 гг.) было опубликовано 404 отчета о рандомизированных исследованиях и проведено 78 метаанализов, посвященных изучению эффективности витамина D при различных клинических ситуациях. Клинико-лабораторное изучение эффективности применения витамина D при лечении больных с инфекционными заболеваниями, с нарушенным D-витаминным статусом, с дефензин-ассоциированными состояниями позволило обосновать необходимость назначения витамина D и показало необходимость дальнейшей разработки критериев показаний для его назначения.

На основании анализа данных, полученных от 18 883 участников Третьего Национального исследования здоровья и питания населения США, Adit A. Ginde и соавт. [15] установили выраженную обратно пропорциональную связь между уровнем концентрации 25-OH-D₃ в сыворотке крови и заболеваемостью острыми респираторными и кишечными заболеваниями. Эпидемиологические исследования свидетельствуют, что дефицит витамина D увеличивает риск заболевания гриппом и острыми инфекциями дыхательных путей. Экспериментальные данные свидетельствуют, что витамин D участвует в противовирусном ответе, особенно против оболочечных вирусов. По всей вероятности, вирулицидная активность витамина D опосредована его способностью индуцировать экспрессию антимикробных пептидов — HBD-2 и кателицидина (LL‑37) [4]. Обработка слизистых оболочек десен кальцитриолом индуцирует экспрессию мРНК VDR и 1a-гидроксилазы в эпителиоцитах. Через 24 часа от начала лечения кальцитриолом увеличивается экспрессия sCD14 в 4 раза, триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках-1, (triggering receptor expressed on myeloid cells-1 — TREM-1), — в 16 раз. Известно, что TREM-1 является ключевым амплифаером неспецифических механизмов защиты макрофагов. Активация TREM-1 обусловливает увеличение экспрессии мРНК IL-8, который индуцирует секрецию дефензинов [45].

В результате слепого двойного рандомизированного плацебо-контролируемого исследования Mitsuyoshi Urashima и соавт. [35] продемонстрировали, что назначение витамина D в пред- и эпидемический период детям в дозе 1200 МЕ/сут сопровождается снижением уровня заболеваемости гриппом практически в два раза. Двойное слепое многоцентровое рандомизированное плацебо-контролируемое исследование эффективности применения витамина D на фоне антибиотикотерапии у 453 детей в возрасте от одного до 36 месяцев с диагнозом внегоспитальной пневмонии позволило установить, что даже однократный прием препарата достоверно снижает риск развития повторной пневмонии [12].

Было установлено, что у афроамериканцев с низкой концентрацией 25-OH-D₃ наблюдается недостаточная индуцибельная экспрессия мРНК кателицидина (LL-37), в связи с чем у них отмечается высокий риск заболевания туберкулезом [40]. Согласно данным многоцентрового рандомизированного плацебо-контролируемого исследования, назначение высоких доз витамина D больным с туберкулезом легких не оказывает существенного влияния на клиническое течение заболевания, но способствует уменьшению продолжительности бактериовыделения у пациентов с полиморфизмом TaqI гена VDR [22].

Назначение витамина D больным с бронхиальной астмой снижает риск развития приступов и повышает чувствительность к терапии глюкокортикостероидными препаратами при тяжелом течении заболевания [30, 39].

У большинства больных с хроническими воспалительными заболеваниями кишечника наблюдается дефицит 1,25(OH)₂D₃. Так, дефицит витамина D регистрируется у 70 % пациентов с болезнью Крона. У мышей с нокаутным геном Vdr отмечается избыточный рост бактериальных колоний в просвете кишечника. Влияние комменсальной и патогенной микрофлоры кишечника стимулирует экспрессию VDR. В исследованиях показано, что ректальное применение 1,25(OH)(2)-16-на-20-циклопропил-витамина D₃ (BXL-62) сопровождалось быстрым выздоровлением мышей с экспериментальным колитом, вызванным декстраном сульфата натрия [13, 47].

В исследовании Antonio Antico и соавт. [23] продемонстрировано значительное снижение уровня 25-OH-D₃ в сыворотке крови пациентов с хроническим аутоиммунным и хроническим Helicobacter pylori-ассоциированным гастритом.

Hamid Nasri и соавт. [32] установили значительную позитивную прямую корреляционную связь между уровнем 25-OH-D₃ и титром специфических антител IgG к Helicobacter pylori у пациентов, находящихся на гемодиализе, что, по мнению авторов, может быть свидетельством потенцирующего действия витамина D на иммунную систему.

Изучение эффективности витамина D позволило не только обосновать необходимость его назначения при лечении больных с инфекционными заболеваниями и с дефензин-ассоциированными состояниями, но и выявило необходимость дальнейшей разработки как клинико-лабораторных показаний для назначения, так и терапевтических и профилактических схем назначения витамина D в конкретных ситуациях.

Заключение

Распространенность дефицита витамина D в человеческой популяции достигает эпидемического уровня, что является фактором, отягчающим течение ряда заболеваний. Витамин D оказывает оптимизирующее влияние на функционирование как неспецифических механизмов защиты, так и адаптивного иммунитета. Понимание его роли в индукции экспрессии антимикробных пептидов позволяет рассмотреть витамин D в качестве возможного лекарственного средства, которое может быть использовано при лечении инфекционных заболеваний, характеризующихся персистирующим течением и невозможностью эрадикации инфекционного агента, в частности Helicobacter pylori.