Журнал «Здоровье ребенка» 1 (36) 2012

Сокращения: HBD (human b­defensins) — человеческий b­дефензин; HD (human defensin) — человеческий a­дефензин клеток Панета; HNP (human neutrophils peptide) — человеческий нейтрофильный пептид.

Бактерицидная, вирулицидная и фунгицидная активность дефензинов

Дефензины обладают широким спектром антибактериальной, противовирусной и противогрибковой активности [250].

Бактерицидная активность дефензинов

Дефензины проявляют выраженную бактерицидную активность по отношению как к грамотрицательным, так и к грамположительным бактериям. Бактерицидное действие дефензинов проявляется через 3–4 часа от момента инфицирования и реализуется в виде многоступенчатого процесса, который включает в себя непосредственное взаимодействие дефензинов с инфекционным агентом, порообразование в клеточной мембране бактерий, интернализацию молекул дефензина с последующим антиметаболическим эффектом (рис. 1). Первичное взаимодействие дефензинов с инфекционными агентами обусловлено электростатическими силами (пептиды несут положительный, а поверхность бактериальной мембраны — отрицательный заряд) и специфическим взаимодействием дефензиновых пептидов с определенными молекулярными детерминантами бактериальной мембраны. Бактерицидность практически всех дефензинов, исключая HBD­3, зависит от концентрации NaCl. При концентрации NaCl выше 150 мкмоль/л происходит достоверное снижение активности дефензинов [83, 92, 108, 155, 233].

Дефензины отличаются по силе бактерицидной активности к различным группам патогенных бактерий (табл. 1). Практически уже в первых исследованиях, посвященных изучению биологических свойств дефензинов, было установлено, что пептиды HNP­1, HNP­2, HNP­3, HD­5, HBD­1, HBD­2 и HBD­3 обладают высокой бактерицидной активностью против широкого круга грамположительных, грамотрицательных бактерий [47, 91, 192]. Особо высокая бактерицидная активность характерна для b­дефензинов с единственной дисульфидной связью в С­терминальном регионе — HBD­1 (ACPIFTKIQGTYRGKAKCK), HBD­2 (FCPRRYKQIGTGLPGTKCK) и HBD­3 (SCLPKEEQIGKSTRGRKCRRKK) [159].

Миелоидные a­дефензины проявляют выраженную бактерицидную активность по отношению к Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus и некоторым другим бактериальным инфектам [34]. Максимальный бактерицидный эффект у HNP отмечается при значениях pH среды от 7 до 8 [217]. По всей вероятности, pH среды влияет на взаимодействие пептида с клеткой­мишенью, изменяя конформацию молекулы пептида или молекулярных структур поверхности стенки бактерии [24]. На основании сравнительного анализа результатов кинетического турбидиметрического метода исследования шести человеческих a­дефензинов Bryan Ericksen и соавт. [70] показали, что миелоидные a­дефензины располагаются в последовательности HNP­2 > HNP­1 > HNP­3 > HNP­4 по уровню активности против Staphylococcus aureus; и в последовательности HNP­4 > HNP­2 > HNP­1 = HNP­3 по силе активности против Escherichia coli. Бактерицидная активность пептида HD­5 против Staphylococcus aureus сравнима с эффективностью HNP­2, а против грамотрицательных бактерий — с эффективностью HNP­4.

Пептид HBD­1 преимущественно проявляет активность по отношению к Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae. В то время как HBD­2 практически не оказывает бактерицидного действия на грамположительные бактерии, но высоко активен по отношению к грамотрицательным бактериям (Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Pseudomonasa eruginosa) и грибам (Candida albicans) [98, 133].

HBD­1 играет особое значение в предотвращении перехода комменсальных бактерий в оппортунистические патогены [1].

Согласно мнению многих исследователей, самым мощным антимикробным пептидом из субсемейства b­дефензинов является HBD­3. Пептид HBD­3 даже в микромолярных концентрациях проявляет выраженную бактерицидную активность против Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Pseudomonasa eruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii [127, 134, 170]. В отличие от других b­дефензинов бактерицидная активность к грамположительным бактериям HBD­3 не зависит от концентрации NaCl [14, 98].

HBD­4 бактерициден по отношению к Staphylococcusc arnosus, Pseudomonasa eruginosa, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniaeи Burkholderia cepacia [124, 195, 234].

Показано, что устойчивые к действию a­ и b­дефензинов штаммы Staphylococcus aureus продуцируют стафилокиназу, которая нарушает вторичную структуру дефензинов [98, 224, 225].

Bruno Rivas­Santiago и соавт. [109] показали, что после инфицирования Mycobacterium tuberculosis в эпителиальных альвеолярных клетках линии А549 происходит индукция экспрессии мРНК HBD­2. Большинство человеческих дефензинов обладают достаточно выраженной бактерицидной активностью против Mycobacterium tuberculosis. Пептид HNP­1 увеличивает скорость эрадикации Mycobacterium tuberculosis H37Rv из организма мышей [219].

Противовирусная активность дефензинов

Дефензины проявляют выраженное противовирусное действие по отношению к оболочечным и безоболочечным, к РНК­ и ДНК­содержащим вирусам (табл. 2).

Вирулицидное действие дефензины проявляют во вне­ и внутриклеточном пространстве.

Пептиды во внеклеточном пространстве HNP и HBD­2 могут индуцировать агрегацию вирусов, в частности вирусов гриппа, и увеличивать активность их поглощения нейтрофилами, а также взаимодействовать с белком сурфактанта D (SP­D), присутствие которого характерно для альвеолярного эпителия, усиливая его противовирусную активность [247].

Было продемонстрировано, что для обеспечения защиты от внутриклеточных инфекционных агентов HNP­1 и HD­5 обладают способностью накапливаться в цитоплазме синтезирующих и несинтезирующих дефензины клеток. Механизмы кумуляции a­дефензинов к настоящему времени практически не изучены. Ehsan Hazrati и соавт. [115] предполагают, что дефензины проникают в клетку путем рецептор­зависимого, рецептор­независимого эндоцитоза или за счет трансмембранного транспорта через неопределенные каналы.

Дефензины нейтрализуют потенции вирусных агентов, непосредственно связываясь с белками капсида, или блокируют проникновение вирусов в клетку (вирусов иммунодефицита человека и вирусов простого герпеса), взаимодействуя со специфическими клеточными рецепторами [65, 115, 221]. В частности, показано, что дефензины оказывают противовирусное действие, ингибируя:

1) экспрессию вирусных рецепторов (например, HBD­3 подавляет экспрессию CXCR4, который является рецептором для вируса иммунодефицита человека 1 [75]; a­дефензины модулируют экспрессию рецептора CD4, взаимодействующего с гликопротеином gp120 вируса иммунодефицита человека 1) [10];

2) функционирование вирусных эндосом (вирусов гриппа, аденовирусов, папилломавирусов);

3) активность протеинкиназы С (PKC), которая необходима для репликации вируса гриппа [9];

4) активность вирусных ДНК и РНК, связываясь непосредственно с нуклеиновыми кислотами [44, 62, 173].

Дефензины обладают противовирусным действием по отношению к респираторно­синцитиальному вирусу, вирусам гриппа A, вирусам парагриппа 3­го типа, риновирусам, аденовирусам, аденоассоциированным вирусам (ААВ), вирусам папилломы человека, но особо активны по отношению к вирусам простого герпеса 1­го и 2­го типа [117, 141].

Kathleen A. Daher и соавт. [42] показали, что нейтрофильный пептид человека HNP­1 непосредственно инактивирует вирус простого герпеса 1­го и 2­го типа, цитомегаловирус. Ehsan Hazrati и соавт. [115], исследуя действие дефензинов при инфицировании герпесвирусом, установили, что все a­дефензины тормозят поражение клетки вирусом. Причем четыре a­дефензина (HNP­1, HNP­2, HNP­3 и HD­5) с высокой степенью аффинитета связываются с гликопротеином B герпесвируса, HNP­4 и HD­6 взаимодействуют с гепарансульфат­протеогликанами поверхности цитоплазматической мембраны клетки; а HBD­3 связывается как с гликопротеином B герпесвируса, так и с гепарансульфат­протеогликанами мембраны клетки.

Согласно данным исследования Mona Doss и соавт. [142], пептиды HNP­1,HNP­2, HNP­3, аминокислотные последовательности которых отличаются друг от друга всего на один аминокислотный остаток, существенно различаются по уровню противовирусной активности по отношению к вирусу гриппа. Так, HNP­1, HNP­2 превосходят по противовирусной активности HNP­3, а пептид HNP­4, аминокислотная последовательность которого существенно отличается от других миелоидных дефензинов, проявляет достоверно менее выраженную нейтрализующую активность по отношению к вирусу гриппа A, чем HNP­1, HNP­2, HNP­3. Миелоидные a­дефензины характеризуются достоверно более высокой вирулицидной активностью против вируса гриппа А (A/PR/8/34/H1N1) по сравнению с противовирусным действием b­дефензинов — HBD‑1 и HBD­2. Однако при достаточно высоком уровне концентрации b­дефензиновых пептидов на слизистой оболочке респираторного тракта их противовирусное действие является саногенетически значимым во время инфекционного процесса, вызванного вирусом гриппа А.

Пептиды HNP­1 и HD­5 при микромолярных концентрациях ингибируют активность аденовирусов (HAdV­5). Jason G. Smith и соавт. [141] показали, что дефензины стабилизируют капсидные белки вируса и высвобождение эндоплазматического протеина VI, тем самым блокируя проникновение вируса в клетку (рис. 2). Пептид HBD­3 также проявляет способность ингибировать жизнедеятельность аденовируса Ad5.F5, в то время как HBD­2 не обладает активностью против данного вируса [221].

В то же время такие безоболочечные вирусы, как ЕСНО­вирус 11­го типа и реовирус 3­го типа, устойчивы к действию дефензинов.

Противогрибковая активность дефензинов

Миелоидные a­дефензины [34] и b­дефензины HBD­2, HBD­3 [19, 146] обладают достаточно выраженной противогрибковой активностью (табл. 3).

Показано, что рекомбинантный HBD­2 практически в 10 раз более фунгициден, чем HBD­3 [243].

Одним из наиболее активных противогрибковых АМП считается представитель семейства обогащенных гистидином белков — гистатин­5 слюны. Гистатин­5 связывается с протеином Ssa на поверхности стенки клетки Candida albicans и транспортируется во внутриклеточное пространство гриба. Интернализированный гистатин­5, активируя транспортер калия Trk1p, обусловливает высвобождение АТФ из внутриклеточного пространства, что приводит к гибели грибковой клетки (рис. 3). Учитывая данные Slavena Vylkova и соавт. [243], которые продемонстрировали наличие специфического взаимодействия пептида HBD­3 с белком теплового шока 70 семейства Ssa1p клеточной мембраны Candida albicans, можно предположить, что по механизму фунгицидного действия HBD­3 подобен гистатину­5 слюны.

Миелоидные a­дефензины оказывают фунгицидное действие независимо от активности транспортера калия TRK1 [158, 165].

Установлено, что дефензины принимают участие в патогенезе аспергиллеза. Людмила Алексеева и соавт. [137] в эксперименте показали, что в ответ на инфицирование Aspergillus fumigatus человеческие бронхиальные эпителиальные клетки (16HBE) и пневмоциты (A549) индуцибельно продуцируют HBD­2 и HBD­9.