Журнал «Здоровье ребенка» 8 (35) 2011

У рамках сучасного підходу до дослідження механізмів розвитку токсикозу при інфекційних захворюваннях у дітей дуже перспективним є вивчення ендотоксинемії, пов’язаної з підвищеним проникненням ендотоксину (ЕТ) з кишечника в системний кровотік [1, 2]. Так, було показано, що в гострому періоді бактеріальних ангін і скарлатини у дітей розвивається ендотоксинемія кишкового походження, вираженість якої залежить від тяжкості основного захворювання [3]. Внаслідок цього токсемія, викликана дією збудників ангіни і скарлатини, може підсилюватися в результаті розвитку патофізіологічних реакцій, що запускаються ЕТ. Відомо, що ЕТ реалізує свої ефекти, зв’язуючись з різними клітинами макроорганізму [4]. Зокрема, моноцити/макрофаги експресують мембранний CD14-рецептор (мCD14), компонент рецепторного комплексу CD14/TLR4/MD2, що розпізнає ЕТ. На окремих гранулоцитах також виявляються рецептори мCD14, однак вони експресуються слабко. Крім того, існує розчинна форма CD14-рецептора (рCD14), що секретується в кров макрофагами і моноцитами [5, 6]. ЕТ, що являє собою ліпополісахарид (ЛПС), взаємодіє з ЛПС-зв’язуючим білком (ЛСБ) і розчинною формою CD14, після чого комплекс ЛПС — ЛСБ зв’язується з мCD14 на поверхні макрофагів. Оскільки мCD14 не має внутрішньоклітинного сигнального домену, то клітинна відповідь на ЛПС залежить від трансмембранного Toll-like-рецептора (TLR), а саме TLR4 [6, 7]. Проведення активаційного сигналу після зв’язування ЛПС є поштовхом до початку експресії генів цитокінів, NO-синтази і генів інших медіаторів, ферментів і регуляторних молекул запалення. У результаті відбувається активація всіх основних клітинних функцій, пов’язаних з розвитком фагоцитозу і представленням антигенів, продукцією NO і вільних форм кисню, синтезом низькомолекулярних медіаторів запалення і групи прозапальних цитокінів, до яких належать інтерлейкіни — ІЛ-1, -6, -18, фактор некрозу пухлини, інтерферони I типу, хемокіни. Одночасно активуються цитокіни, що стимулюють диференціювання Т-лімфоцитів хелперів I типу — ІЛ-12, -23, -27. У свою чергу, цитокіни відіграють провідну роль в індукції відповіді гострої фази запалення [5, 8–10]. Таким чином, динаміка клітинної активації, пов’язаної з розвитком ендотоксинемії, залежить від рівня експресії мCD14 моноцитами/макрофагами, який, у свою чергу, визначає динаміку синтезу ряду медіаторів запалення, тобто вираженість запальної відповіді.

Метою дослідження стало визначення щільності експресії рецептора CD14 на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові у дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину, залежно від рівня ендотоксинемії кишкового походження.

Матеріал і методи дослідження

Обстежені 90 хворих віком від 2 до 6 років, які перебували на лікуванні в КРУ «Дитяча інфекційна клінічна лікарня» м. Сімферополя за період 2005–2008 рр.

Усі обстежені діти були розподілені на 4 групи. До 1-ї групи ввійшли 34 хворі на бактеріальну ангіну середнього ступеня тяжкості, до 2-ї групи — 29 хворих із тяжкою формою ангіни, 3-тю групу становили 15 хворих із середньотяжкою формою скарлатини, до 4-ї групи ввійшли 12 хворих із тяжкою формою скарлатини, причому тяжкість була зумовлена розвитком бактеріальних ускладнень (синусит, лімфаденіт, отит, паратонзиліт) і метаболічних розладів. Матеріалом дослідження була периферична кров, яка забиралась у гострому періоді захворювання (при надходженні в стаціонар і на 2-гу — 3-тю добу перебування) та перед випискою зі стаціонару.

Групу порівняння становили 25 здорових дітей віком від 2 до 6 років.

Рівень експресії рецептора CD14 моноцитами і гранулоцитами периферичної крові визначали методом проточної лазерної цитофлуориметрії, використовуючи як флуоресцентно мічений ліганд кон’югат ЛПС E. coli K235 з флуоресцеїнізотіоціанатом і моноклональні антитіла (МКА) до антигену CD14, мічені фікоеритрином [11]. Для аналізу результатів використовували програмне забезпечення Partec FloMax V, 2,4d (Partec GmbH, Munster, Германия). Результат виражали в умовних одиницях флюоресценції (у.о.фл.).

Визначення кількісного вмісту ендотоксину в сироватці крові хворих здійснювали методом хромогенного аналізу за кінцевою точкою, за яким після змішування ЛАЛ-реактиву Endosafe^® Endochrome з досліджуваним зразком вимірювали жовте забарвлення, що з’являється в реакційній суміші, за допомогою спектрофотометра при довжині хвилі 405–410 нм [3, 12]. Інтенсивність забарвлення була прямо пропорційною вмісту ендотоксину в зразку. Концентрацію ендотоксину в зразку визначали за калібрувальною кривою, а результат виражали в міжнародних одиницях ендотоксину/мл (МОЕ/мл).

Результати досліджень та їх обговорення

Як видно з табл. 1, показник експресії мембранного CD14-рецептора на моноцитах при надходженні до стаціонару підвищувався в групах хворих на ангіни як середньої, так і тяжкої форм (1-ша — 2-га групи) на 21 і 53 % відповідно (р < 0,05 — р < 0,001) порівняно з групою здорових дітей. При цьому показник у хворих із тяжкою формою ангіни на 26 % перевищував показник хворих із середньотяжкою формою (р₂ < 0,01). У хворих на скарлатину (3-тя — 4-та групи) рівень експресії мCD14 також підвищувався на 37–42 % відповідно (р < 0,001), але при цьому вірогідно не залежав від ступеня тяжкості (р₂ > 0,2). Така динаміка мCD14-рецептора у хворих усіх 4 груп цілком закономірна, оскільки на цьому самому етапі дослідження рівень ЕТ у сироватці крові був підвищений [3].

Показники експресії мCD14, отримані у хворих із середньотяжкими формами ангін і скарлатини до 3-го дня перебування в стаціонарі, виявилися схожими з результатами при надходженні. Рівень експресії мCD14 залишався підвищеним (р < 0,01) і вірогідно не відрізнявся від показника при надходженні, при цьому він узгоджувався з підвищеною концентрацією ЕТ в сироватці крові хворих на цьому етапі досліджень.

У той же час у хворих із тяжкими формами захворювань (2-га і 4-та групи) на тлі збільшення концентрації ЕТ удвічі показник рецепторної експресії на моноцитах, навпаки, помірно знижувався на 11–19 % відповідно (р₁ < 0,05) порівняно з показником при надходженні, залишаючись при цьому вірогідно вищим за фізіологічну норму. Зниження щільності експресії рецептора у хворих цих груп може бути зумовлене розвитком функціональної нездатності моноцитів в умовах надмірної стимуляції мембранних рецепторів ендотоксином [10].

Відомо, що стимулюючий ефект на мононуклеарні фагоцити справляють лише низькі дози ЕТ, тоді як більш високі, навпаки, блокують їх основні функції [13]. Також є наукові дані про те, що в умовах ендотоксинемії порушується передача внутрішньоклітинного сигналу та змінюється цитоскелет моноцитів/макрофагів, що призводить до функціональної неповноцінності фагоцитів і їх депресії [14–16].

Згідно з результатами наших досліджень, щільність експресії мCD14, що залежить від рівня ендотоксинемії в сироватці крові хворих, непрямо пов’язана з тяжкістю перебігу основного інфекційного захворювання. Так, хоча концентрація ЕТ у сироватці крові мала тенденцію до наростання у хворих усіх 4 груп, однак у пацієнтів із тяжкими формами ангін і скарлатини вона була в 2 рази вищою, ніж у хворих із середньою тяжкістю, що призводило до порушення функціональної здатності моноцитів експресувати мCD14 у хворих із тяжкими формами захворювання.

Слід зазначити, що, з одного боку, зниження здатності моноцитів експресувати мCD14 при тяжкому перебігу інфекційного захворювання може призвести до зриву імунної відповіді, починаючи з неадекватного синтезу медіаторів запалення і закінчуючи порушенням антитілопродукції, що небезпечно в плані розвитку ускладнень і можливої генералізації інфекційного процесу. З іншого боку, цей феномен може бути неспецифічним захисним механізмом, що має на меті попередження розвитку неконтрольованого запального каскаду, так званої медіаторної бурі, внаслідок якої розвиваються шок і поліорганна недостатність (ПОН). Більшість досліджень, що свідчать про негативний вплив зниження щільності експресії мCD14, були проведені у хворих, які перебували в критичному стані. Зокрема, встановлено, що значне зниження щільності експресії мCD14 на моноцитах у хворих із тяжкими пневмоніями і сепсисом були в прямій залежності від летального наслідку захворювання [17, 18]. Крім того, доведено, що зниження експресії мCD14 і фагоцитарної активності моноцитів/макрофагів пов’язане зі зростанням ризику розвитку бактеріальних ускладнень у хворих [19, 20]. Ґрунтуючись на даних наукової літератури і результатах наших досліджень, можна зробити висновок, що помірне зниження щільності мCD14-рецептора на моноцитах у гострому періоді перебігу тяжкого інфекційного захворювання може відігравати компенсаторну роль, тоді як значне зниження експресії мCD14 свідчить про декомпенсацію механізму клітинної активації, є патологічним, що веде до повного зриву імунної відповіді і, в результаті, можливо, до фатального наслідку захворювання.

Під час виписки зі стаціонару рівень експресії CD14-рецептора на моноцитах відповідав фізіологічним показникам у більшості хворих, за винятком хворих із тяжкою формою скарлатини, у яких він залишався вищим за норму на 16 % (р < 0,02).

Аналізуючи динаміку експресії CD14-рецептора гранулоцитами, ми враховували первісно слабку здатність гранулоцитів на відміну від моноцитів експресувати CD14-рецептор [5]. На момент надходження до стаціонару у хворих 1–4-ї груп рівень експресії мCD14-рецептора підвищувався в середньому на 17–27 % (р < 0,01 — р < 0,001), вірогідно не відрізняючись залежно від ступеня тяжкості захворювання.

На 3-й день перебування в стаціонарі, під час найбільш вираженої ендотоксинемії, показник експресії мCD14 у хворих на ангіни (1-ша і 2-га групи) залишався підвищеним (р₁ < 0,05 — р₁ < 0,01) і вірогідно не відрізнявся від показника при надходженні. У той же час у хворих на скарлатину (3-тя і 4-та групи) він відповідав рівню здорових дітей.

На момент виписки зі стаціонару рівень експресії CD14-рецептора на гранулоцитах у хворих усіх 4 груп не відрізнявся від фізіологічного.

Таким чином, нами вперше виявлено, що у відповідь на підвищення рівня ендотоксину кишкового походження в системному кровотоку хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину збільшувалася щільність експресії CD14-рецепторів на моноцитах периферичної крові, рівень якої прямо залежав від тяжкості захворювання. У гострому періоді хвороби, при наростанні концентрації ЕТ у сироватці крові хворих із тяжкими формами, рівень експресії мCD14-рецепторів помірно знижувався, що свідчило про пригнічення механізмів клітинної активації в умовах вираженої ендотоксинемії. Щільність експресії CD14-рецепторів на гранулоцитах периферичної крові хворих на ангіни і скарлатину при розвитку ендотоксинемії теж підвищувалась, однак через низьку здатність гранулоцитів експресувати мCD14-результати були не такі показові.

Висновки

1. Підвищення рівня ЕТ кишкового походження в сироватці крові дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину, супроводжується збільшенням експресії CD14-рецептора на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові в гострому періоді захворювання, що може підсилювати активність запального процесу і вираженість інфекційного токсикозу.

2. Установлена залежність між тяжкістю інфекційного процесу та ендотоксинзалежною активацією експресії мCD14 на моноцитах периферичної крові хворих.

3. Виявлено, що функціональна здатність моноцитів до експресії мCD14 пригнічується у хворих із тяжкими формами ангін і скарлатини в умовах розвитку вираженої ендотоксинемії, при цьому помірне зниження щільності експресії мCD14, очевидно, відіграє компенсаторну роль, попереджаючи розвиток медіаторної бурі, а значне — може бути ознакою декомпенсації і свідчити про зрив імунної відповіді та безпеку фатального наслідку хвороби.