Журнал «Здоровье ребенка» 8 (35) 2011

Вступ

Однією з ланок патогенезу цукрового діабету 1-го типу (ЦД-1) є метаболічні розлади, зумовлені порушення вуглеводного обміну. Вони лежать в основі мікро- та макроангіопатій, що клінічно проявляються різноманітними хронічними діабетичними ускладненнями. Саме вони порушують якість та тривалість життя дітей із ЦД-1. Більшість процесів в організмі здійснюється із затратами енергії. Енергетичні витрати особливо підвищуються в умовах фізіологічного (інтенсивний ріст, пубертатний період) та патологічного навантаження (в умовах порушеного обміну речовин). Тому важливо дослідити особливості стану енергетичного забезпечення у разі цукрового діабету 1-го типу в дітей при різних рівнях компенсації вуглеводного обміну.

Головним джерелом енергії є глюкоза. За участю реакцій гліколізу (аеробного та анаеробного) із неї утворюється аденозинтрифосфатаза (АТФ), молекули якої використовуються на всі енергозатратні реакції, що відбуваються у клітинах. Синтез АТФ здійснюється у мітохондріях за участю ферментів циклу Кребса [1]. Одним із найбільш об’єктивних та зручних у використанні маркерів стану аеробного гліколізу є активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) лімфоцитів периферичної крові. Даний ензим міцно пов’язаний із внутрішньою мембраною мітохондрій, і його функція не залежить від системи НАД/НАДН⁺, що дозволяє зберегти енергосинтезуючу активність мітохондрій в умовах гіпоксії.

Лактатдегідрогеназа (ЛДГ, К.Ф.1.1.1.27) — цитозольний цинкумісний фермент анаеробного гліколізу, каталізує зворотну реакцію окислення L-лактату в піруват [2].

Визначення активності вказаних ферментів дозволить вивчити особливості енергетичного забезпечення у дітей, хворих на ЦД-1, та провести подальшу корекцію метаболічних порушень.

Мета роботи: за показниками активності ферментів крові аеробного та анаеробного гліколізу дослідити стан енергетичного забезпечення дітей, хворих на ЦД‑1, залежно від рівня глікемічного контролю. На основі встановлених особливостей стану енергетичного забезпечення провести його корекцію вітаміно­мікроелементумісним препаратом вітам.

Матеріали і методи дослідження

Під спостереженням знаходилося 70 дітей, хворих на ЦД-1. Стан компенсації ЦД-1 оцінювався згідно з ISPAD (Consensus for the Management of Type 1 Diabetes Mellitus in Children and Adolescents 2000). Оптимальний рівень глікемічного контролю (ГК) мали 10 дітей (група I), субоптимальний — 30 (група II), рівень ГК із високим ризиком для життя (ГКВР) — 30 хворих (група III). Групу порівняння становили 30 практично здорових дітей.

Стан аеробного гліколізу оцінювали за активністю СДГ у лімфоцитах периферичної крові, яку визначали кількісним цитохімічним методом Пірса (1957) у модифікації Р.П. Нарциссова (1969) із використанням нітросинього тетразолію фірми Sigma-Aldrich (Швейцарія) [3]. Матеріалом для дослідження була периферійна кров, яку забирали з пальця вранці з 8.00 до 9.00 натщесерце та відразу готували нативні мазки. Метод ґрунтується на властивості паранітротетразолію фіолетового утворювати у місцях локалізації СДГ нерозчинні у воді гранули формазану. Підрахунок гранул формазану здійснювали у 50 лімфоцитах під мікроскопом «Біолам Р-15», окуляр 10 ґ 40. Підраховували загальну кількість гранул у клітині, загальну кількість лімфоцитів із гранулами формазану, а також визначали показник співвідношення загальної кількості гранул до загальної кількості клітин із гранулами формазану (гранул/клітину).

Стан анаеробного гліколізу визначався за активністю ЛДГ у сироватці крові, яку досліджували кінетичним методом за допомогою наборів реактивів фірми «Ольвекс Диагностикум» (Росія) на напівавтоматичному фотометрі Mikrolab 300 (США). Дослідження проводили при довжині хвилі 340 нм та температурі 37 °С.

Корекцію встановлених енергетичних порушень здійснювали вітаміномікроелементумісним препаратом вітам. Дітям віком від 4 до 13 років призначали по 1 капсулі 1 раз на добу, дітям після 14 років — по 2 капсули 1 раз на добу. Курс прийому становив 30 днів. Корекція не проводилася хворим, які мали гострі ускладнення цукрового діабету (кома). Одночасно хворі отримували стандартну інсулінотерапію. На тлі прийому препарату особлива увага приділялась показникам глікемії (глікемічний профіль), контроль якої обов’язково проводився 2 рази на тиждень. Добова потреба в інсуліні розраховувалася щоденно.

Статистична обробка результатів досліджень здійснювалася за допомогою програми Exсel. Використовувалися методи варіаційної статистики, придатні для медико-біологічних досліджень [4]. Для всіх показників визначали середньоарифметичне (М), похибку середньоарифметичного (m). Показник вірогідності (p) визначали за допомогою критерію Стьюдента (t). Показники парної кореляції використовували для оцінки характеру та ступеня взаємозв’язку між різними параметрами. Для визначення ступеня впливу різноманітних факторів на активність ферментів був застосований двофакторний дисперсійний аналіз [4].

Результати і їх обговорення

Серед показників, що характеризують активність СДГ, є загальна кількість клітин із гранулами формазану. Встановлено, що навіть у разі компенсації ЦД-1, тобто у випадку оптимального рівня ГК, їх кількість була на 19 % меншою від групи порівняння. Причому діапазон коливань був від 25 до 38 клітин. У фізіологічних умовах глюкоза надходить до клітин за допомогою білка-транспортера, розташованого в плазматичній мембрані, активність якого регулюється інсуліном. Надалі глюкоза підключається до процесів аеробного гліколізу, під час яких утворюється АТФ [5]. В умовах інсулінової недостатності у разі ЦД-1 надходження глюкози до клітин порушується, проте активується глікогеноліз, який на деякий час підтримує енергозабезпечення. Можливо, саме тому загальна кількість клітин із гранулами формазану в дітей II та III груп не відрізнялася від показників здорових дітей (табл. 1), тому що це є компенсаторно-пристосувальною реакцією організму. Звертає увагу той факт, що розмах показників був досить значним. Зокрема, у разі субоптимального рівня ГК він становив від 28 до 45, а у випадку ГКВР — від 25 до 55 клітин із гранулами формазану. Проте показник загальної кількості гранул формазану був одночасно зниженим у дітей всіх груп, причому мав невеликий розмах коливань (від 312,67 до 318,24). У середньому він був майже на 36 % нижчим , ніж у групі порівняння (табл. 1).

Найбільш важливим показником активності СДГ та стану аеробного гліколізу є коефіцієнт співвідношення загальної кількості гранул до загальної кількості клітин із гранулами формазану [6]. Встановлено, що у разі оптимального рівня ГК мало місце зниження даного показника на 13 % щодо здорових дітей (табл. 1). Діапазон коливань даного показника у них був від 8,3 до 12. У випадку субоптимального рівня ГК розмах співвідношення загальної кількості гранул до загальної кількості клітин із гранулами був ще більшим — від 5 до 12,5. У середньому він на 32 % був меншим від групи порівняння. У пацієнтів із ГКВР діапазон коливань гранул/клітину становив від 5 до 13,5, що у середньому становило 8,55 та виявилося на 32 % нижчим, ніж у здорових пацієнтів.

Під час дослідження впливу тривалості ЦД-1 та рівня глікемічного контролю на морфометричні показники активності СДГ лімфоцитів за результатами двофакторного дисперсійного аналізу встановлено, що більшість із них мають залежність від стану компенсації діабету (рис. 1).

Зокрема, рівень глікемічного контролю має переважне значення для загальної кількості клітин із гранулами формазану та показника гранул/клітину із силою дії чинника 54,2 та 55,6 % відповідно. Слід зазначити, що загальна кількість гранул залежить на 20,2 % від рівня ГК та на 24,9 % від одночасної взаємодії даного фактора із тривалістю діабету.

Відомо, що підвищити активність металоензимів на клітинному рівні можливо за рахунок мікроелементів (МЕ), що входять до активного центру ферментів [7]. Серед існуючих на українському фармацевтичному ринку вітаміномікроелементумісних препаратів нашу увагу привернув вітам. Він являє собою набір шести металоензимів (залізо, хром, мідь, марганець, цинк, кобальт) у вигляді комплексів з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (MLn) із мольним співвідношенням 50 : 50 : 15 : 10 : 1 : 1 та вітамінів групи В (рибофлавін, тіамін, нікотинамід, піридоксин, кальцію пантотенат). На думку С.О. Мисливець, склад композиції відповідає мольному співвідношенню металів, обґрунтованому аналітичними даними щодо балансу ендогенних d-металів в організмі [8]. Наявність МЕ у вигляді координаційних сполук сприяє їхньому включенню до активних центрів металозалежних ферментів [9]. Це дало змогу застосувати його для підвищення активності СДГ.

Встановлено, що до активного центру СДГ входить залізо, причому головні свої функції воно реалізує переважно в ядрі клітин, де знаходиться найбільша кількість залізовмісних ферментів. Можливо, це і стало причиною покращення морфометричних показників активності ферменту після лікування, що мали в усіх групах обстежених односпрямований характер (табл. 1). Так, загальна кількість клітин із гранулами збільшилась у дітей I групи на 16 %, у пацієнтів II групи — на 13 %, а у хворих III групи — на 10 %, причому вона зросла до показників здорових пацієнтів. Загальна кількість гранул формазану в клітинах підвищилася практично в усіх хворих на ЦД-1 дітей на 38 % і також відповідала групі порівняння. Показник співвідношення загальної кількості гранул до загальної кількості клітин із гранулами зростав нерівномірно. Зокрема, у дітей III групи — на 33 %, у хворих II групи — на 31 %, у пацієнтів I групи — лише на 12,4 %. Проте в усіх у них він майже відповідав значенню здорових. За даними В.І. Похілько, лімфоцити не тільки відповідають за імунний захист, але і є об’єктивним відображенням стану організму в цілому, причому в певний проміжок часу або під дією тих чи інших факторів [10].

Таким чином, можна припустити, що на фоні терапії даним вітаміномікроелементумісним препаратом відбувається активація одного з головних ферментів мітохондрій, що призводить до покращення клітинного метаболізму, яке проявляється збільшенням кількості активних лімфоцитів. У свою чергу, підвищення активності СДГ призводить до покращення аеробного гліколізу, відображенням чого може бути зменшення рівня глікемії внаслідок покращення утилізації глюкози.

Однією з характерних особливостей СДГ є її незалежність від концентрацій окисленої та відновлювальної форм НАД/НАДН⁺. Зазначене явище дозволяє на деякий час зберегти енергосинтезуючу функцію мітохондрій в умовах гіпоксії у разі порушення НАД-залежного дихання клітин. Проте в умовах хронічного кисневого голодування з метою адекватного забезпечення клітин енергією активується анаеробний гліколіз [11], що призводить до накопичення лактату. Саме тому як об’єктивне відображення інтенсивності даного шляху енергозабезпечення було обрано визначення активності загальної ЛДГ у сироватці крові.

Встановлено, що активність ЛДГ сироватки крові була збільшена у 3–4 рази в усіх дітей, хворих на ЦД-1, причому діапазон коливань показників був досить значним — від 253,3 до 3558,7 Од/л.

За результатами аналізу вмісту ензиму залежно від рівня глікемічного контролю з’ясовано, що найбільша активність ферменту була встановлена у хворих I групи (рис. 2). Так, у них вона виявилась у 4,4 раза більшою від групи порівняння. У хворих II групи мало місце підвищення ЛДГ у 3,6 раза порівняно зі здоровими дітьми. Стабільно високою активність ЛДГ залишалась і у пацієнтів III групи. Так, у них показник вмісту ферменту в сироватці крові був у 3 рази вищим від показника здорових.

Двофакторний дисперсійний аналіз показав, що на вміст ЛДГ у сироватці крові суттєво впливає тривалість ЦД-1 із силою дії 26,4 % та її взаємодія з рівнем ГК, оскільки сила їх одночасного впливу становить 39,2 %. Окремо рівень ГК має значення лише 7 % (рис. 3).

За даними аналізу кореляції між рівнями ЛДГ та показником, що найбільш точно характеризує активність СДГ (гранул/клітину), у дітей I та II груп вона була сильною негативною (r = –0,78 та r = –0,97 відповідно), проте у пацієнтів III групи взагалі втрачалася (r = –0,05).

На фоні терапії препаратом активність ЛДГ хоч і знижувалась, але до показників здорових не наближалася (рис. 2). Найбільше, на 34,1 %, знизився рівень ЛДГ у пацієнтів із ГКВР (p < 0,01), причому в них він був найменшим щодо групи порівняння. У хворих із оптимальним та субоптимальним рівнями ГК було встановлено зменшення вмісту ЛДГ на 26 %. Проте її концентрація у сироватці крові залишалася майже у 3 рази вищою щодо здорових дітей.

Таким чином, при погіршенні рівня глікемічного контролю погіршується енергетичне забезпечення клітин. Це підтверджується зміною морфометричних показників цитохімічної активності мітохондріального ферменту СДГ. Встановлено, що зниження загальної кількості клітин із гранулами відбувається навіть у випадку оптимального рівня ГК і може свідчити про ранній розвиток метаболічних порушень у даної категорії хворих на ЦД-1 дітей. Проте у разі субоптимального рівня ГК та ГКВР відбувається напруження компенсаторних реакцій, тобто збільшення загальної чисельності клітин із гранулами формазану до показників здорових, що може призвести до швидкого виснаження їх функціональної активності. Слід зауважити, що такі показники, як загальна кількість гранул формазану та коефіцієнт співвідношення гранул/клітину, виявилися зниженими в усіх хворих на ЦД-1. Таким чином, цитохімічні показники лімфоцитів є свідченням існування індивідуальних особливостей аеробного гліколізу, що дуже залежать від стану компенсації ЦД-1. Підтвердженням є значна залежність морфометричних показників активності СДГ від рівня глікемічного контролю, яка була встановлена за допомогою двофакторного дисперсійного аналізу.

В умовах зниженого надходження кисню активується анаеробний гліколіз, що на деякий час забезпечує клітини адекватною енергією. Одним із маркерів даного шляху окислення глюкози є активність ЛДГ сироватки крові, показник якої збільшується, за нашими дослідженнями, в усіх хворих на ЦД-1. Слід зазначити, що цей показник корелює з рівнем СДГ лише у випадку оптимального та субоптимального рівнів глікемічного контролю. Крім того, у цих обстежених вміст ЛДГ та морфометричні показники активності СДГ були вищими, ніж у хворих III групи. Можна припустити, що у разі ГКВР відбувається зрив компенсаторних можливостей, направлених на адекватне енергозабезпечення. Ознакою такого припущення може бути незначне підвищення рівня ЛДГ порівняно зі здоровими та відсутність кореляції між умістом ЛДГ у сироватці крові та коефіцієнтом співвідношення гранул/клітину.

Застосування вітаміномікроелементумісного препарату сприяє покращенню аеробного та зменшенню інтенсивності анаеробного гліколізу. Але відсутність повної нормалізації ЛДГ може бути викликана посиленою потребою клітин в енергії та є адаптаційно-компенсаторною реакцією.

Слід зазначити, що проведене дослідження показало добру переносимість вітамінно-мікроелементного комплексу в дітей незалежно від віку, рівня глікемічного контролю та хронічних діабетичних ускладнень. Під час використання препарату не було зареєстровано погіршення показників вуглеводного обміну та збільшення потреби в інсуліні. Також не було зафіксовано випадків відмови від застосування препарату та алергічних реакцій. Таким чином, застосування вітамінно-мікроелементного препарату у комплексній терапії цукрового діабету 1-го типу сприяє покращенню енергетичного забезпечення.

Висновки

1. Цукровий діабет 1-го типу у дітей супроводжується енергетичним дисбалансом, що проявляється зниженням активності аеробного та активацією анаеробного гліколізу.

2. На активність ферментів аеробного гліколізу переважний вплив має рівень глікемічного контролю, у той час як анаеробний гліколіз залежить від одночасної взаємодії рівня глікемії із тривалістю цукрового діабету.

3. Включення вітаміномікроелементумісного препарату вітам до схеми терапії цукрового діабету 1-го типу в дітей сприяє покращенню стану енергетичного забезпечення.