Журнал «Здоровье ребенка» 6 (33) 2011

Сокращения: AMAC (alternative macrophage activation­associated CC chemokine) — альтернативный макрофагальный СС­хемокин, ассоциированный с активацией; ATAC (activation­induced, chemokine­related molecule) — индуцирующая активацию хемокинсвязанная молекула; BCA (B­cell attracting chemokine) — хемокин, привлекающий В­лимфоциты; BRAK (breast­ and kidney­expressed chemokineх) — хемокин, экспрессируемый в молочной железе и почках; CCL (chemokine (C­C motif) ligand) — хемокиновый (С­С мотива) лиганд; CCR6 (chemokine (C­C motif) receptor 6) — хемокиновый (С­С мотива) рецептор 6; CTACK (cutaneous T cell­activating chemokine) — хемокин Т­клеточной активации; DC­CK1 (dendritic cell­derived CC chemokine) — СС­хемокин дендритных клеток; ELC (EBL­1 ligand chemokine) — EBL­1 хемокиновый лиганд; ENA­78 (epithelial neutrophil activating peptide 78) — эпителиально­нейтрофильный активирующий пептид 78; ERK1/2 (extracellular signal­regulated kinase 1/2) — экстрацеллюлярная сигналрегулируемая киназа 1/2; FAK (focal adhesion kinase) — местная киназа адгезии; GCP (granulocyte chemotactic protein) — протеин хемотаксиса гранулоцитов; GRO (Growth­regulated oncogene) — регулирующий рост онкоген; HBD (human b­defensin) — человеческий b­дефенсин; HCC (human CC chemokine) – человеческий СС хемокин; ILC (IL­11 recepter a­locus chemokine) — интерлейкин­11 рецептор a­локус хемокина; IP (IFNg­inducible protein) — интерферон­g — индуцибельный протеин; I­TAC (IFN­inducible T­cell chemoattractant) — интерферониндуцибельный Т­клеточный хемоаттрактант; LARC (liver­ and activation­regulated chemokine) — регулирующий активацию хемокин печени; LEC (liver­expressed chemokin) — хемокин, экспрессируемый печенью; Lkn (leukotactin) — лейкотактин; MCAF (monocyte chemotactic and activating factor) — моноцитарный хемотактический и активирующий фактор; MCP (monocyte chemoattractant protein) — моноцитарный хемотактический протеин­1; MDC (monocyte­derived chemokine) — моноцитарный хемокин; MEC (mucosae­associated epithelial chemokine) — эпителиальный хемокин, ассоциированный со слизистой оболочкой; MGSA (melanoma growth stimulatory activity) — ростовой стимулятор активности меланомы; MIG (monokine­induced by IFNg) — монокин, индуцированный IFNg; MIP (macrophage inflammatory protein) — макрофагальный воспалительный протеин; MPIF (myeloid progenitor inhibitory factor) — фактор ингибирования миелоидных предшественников; MUC5AC (mucin 5AC) — муцин 5AC; NAP (neutrophil­activating peptide) — нейтрофилактивирующий пептид; NF­kB (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B­cell) — нуклеарный фактор транскрипции каппа В; NKT (natural killer T) — натуральные киллеры Т (CD3+ CD56+) ; PAMP (pathogen­associated molecular patterns) — патогенассоциируемые молекулярные структуры; PARC (pulmonary­ and activation­regulated chemokine) — регулирующий активацию хемокин легких; PF (platelet factor) — тромбоцитарный фактор; Pyk­2 (pyruvate kinase) — пируваткиназа 2; ROR (RAR­related orphan receptor) — RAR­связанный рецептор; SCM (Single C motif) — единственный С­мотив; SDF­1 (stromal cell­derived factor 1) — фактор­1 стволовых клеток; SLC (secondary lymphoid tissue chemokine) — хемокин вторичной лимфоидной ткани; STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) — сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции­3; STCP (stimulated T cell chemoattractant protein) — хемоаттрактантный протеин, стимулирующий Т­клетки; TACE (metalloprotease TNF­a­converting enzyme) — металлопротеазный TNF­a­конвертирующий фермент; TARC (thymus­ and activation­regulated chemokine) — регулирующий активацию хемокин тимуса; TECK (thymus­expressed chemokine) — хемокин, экспрессируемый тимусом; TLR (toll­like receptor) — Toll­подобный рецептор; Treg (regulatory T cells) — Т­регулирующие клетки.

Введение

Эпителиальные клетки респираторного тракта участвуют как в защите макроорганизма от инфекционных агентов, так и в регуляции воспалительного процесса, в частности, активно продуцируя некоторые хемокины. После идентификации в 1987 году IL­8/CXCL8 как первого протеина, влияющего на хемотаксис клеток, семейство хемокинов человека прогрессивно увеличивалось, и в настоящее время оно состоит из более чем 54 представителей. Хемокины, которые являются небольшими (8–14 kDa) гепаринсвязывающими положительно заряженными протеинами, участвуют в регуляции иммунных реакций, дифференцированно активируя хемотаксис различных иммуноцитов. Свою активность они реализуют, специфически взаимодействуя более чем с двадцатью различными G­протеиновыми рецепторами (G protein­coupled receptors — GPCR), экспрессируемыми на клетках­мишенях. Хемокиновые протеины содержат от 70 до 100 аминокислотных остатков [17, 42]. Кроме участия в развитии воспаления, хемокины играют роль и в других биологических процессах. В частности, они принимают активное участие в процессе кроветворения, ангиогенезе, непосредственной неспецифической антимикробной защите макроорганизма. В последнее время было установлено, что некоторые хемокины, такие как CCL20/MIP­3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP­10 и CXCL11/I­TAC, обладают выраженной антибактериальной активностью против Streptococcus pyogenes [34], CCL4/MIP­1b, CCL5/RANTES проявляют противовирусную активность и играют важнейшую роль в процессе неспецифической защиты респираторного тракта от инфекционных агентов [27, 30].

Краткая характеристика хемокина CCL20/MIP­3a

Хемокин CCL20/MIP­3a (CCL20 — chemokine (C­C motif) ligand 20, MIP­3a — макрофагальный белок воспаления 3a) первоначально был определен в ткани печени и получил название LARC (liver and activation­regulated chemokine). Другими синонимами CCL20/MIP­3a являются Exodus­1, CKb4, MIP3A, SCYA20, ST38, small inducible cytokine subfamily A (Cys­Cys), member 20 [33]. Хемокин CCL20/MIP­3a структурно и функционально близок к дефензинам­b (HBD) [36].

В зависимости от наличия одного или двух цистеиновых аминокислотных остатков (С) в N­терминальном регионе молекул и расположения С в аминокислотной последовательности человеческие хемокины разделены на 4 субсемейства: субсемейство C, включающее 15 хемокинов, субсемейство CC, включающее 27 хемокинов (CCL1­27), субсемейство CXC, включающее 15 хемокинов (CXCL1­15), и субсемейство CX₃C (табл. 1). CCL20/MIP­3a относится к группе Exodus субсемейства СС, которая состоит из Exodus­1 (CCL20), Exodus­2 (CCL21), Exodus­3 (CCL19) [17].

Молекула CCL20/MIP­3a состоит из 70 аминокислотных остатков, содержит две дисульфидные связи и имеет молекулярную массу 8 kDa. Интересно отметить, что в молекуле CCL20/MIP­3a существует единственный мотив Asp­Cys­Cys­Leu, который находится и в молекулах hMIP­3a, hExodus­2 и mExodus­2, mTECK и MC10­подобного белка [28].

В настоящее время идентифицированы две молекулярные изоформы протеина CCL20/MIP­3a, которые различаются одним аминокислотным остатком в N­терминальном регионе: одна изоформа содержит остаток аланина в 27­м положении, а другая — нет. Неоднородность протеинов CCL20/MIP­3a, возникающая на уровне транскрипции, обусловлена альтернативным сплайсингом. Изоформа CCL20/MIP­3a, содержащая Ala²⁷, в 2 раза более активна по хемотаксическому действию на Т­лимфоциты, но не превышает активности изоформы CCL20/MIP­3a, не содержащей Ala²⁷, по влиянию на мононуклеарные клетки [32].

Молекула CCL20/MIP­3a в кислотной среде присутствует в качестве мономера, а при высоком уровне pH (7,0 и выше) приобретает димерную форму. Основную роль при димеризации играет His⁴⁰ аминокислотный остаток CCL20/MIP­3a [10].

В отличие от большинства человеческих CC­хемокиновых генов, которые картированы на хромосоме 17, ген, кодирующий синтез CCL20/MIP­3a, расположен на хромосоме 2q33­q37 (gene ID: 6364) [33].

Продукция CCL20/MIP­3a

Хемокин CCL20/MIP­3a продуцируется как конститутивно, так и индуцибельно [33]. В бронхоальвеолярной жидкости практически здоровых людей концентрация CCL20/MIP­3a находится на уровне 10,4 пг/мл, а у больных муковисцидозом ее уровень резко повышен и достигает 907 пг/мл [4]. Характер стимулирующего сигнала предопределяет тип клеток, которые станут основными продуцентами индуцибельного CCL20/MIP­3a. Патогенассоциируемые молекулярные структуры (PAMP) и макрочастицы индуцируют секрецию CCL20/MIP­3a преимущественно эпителиоцитами слизистой оболочки бронхов, а цитокины активируют продукцию CCL20/MIP­3a макрофагами, альвеолоцитами II типа, нейтрофилами, фибробластами [1, 31, 37]. Необходимо подчеркнуть, что при TLR­зависимом возбуждении хемокиновой продукции эпителиальные клетки в основном секретируют CCL20/MIP­3a, а фибробласты и лейкоциты — в большей степени MCP­1 и IL­8. В процессе развития воспаления уровень продукции CCL20/MIP­3a сопоставим с объемом продукции MCP­2 и MCP­3, но значительно ниже, чем таковой IL­8 и MCP­1 [32]. Установлено, что провоспалительные цитокины (IL­1_b, ТNF­a и интерферон­g) и Тh₂­ассоциированные интерлейкины (IL­4 и IL­13) усиливают синтез CCL20/MIP­3a, активируя фактор транскрипции NF­kB через внутриклеточные сигнальные компоненты ERK1/2 или p38 [1, 2, 40]. Так, концентрация CCL20/MIP­3a в бронхоальвеолярной жидкости после воздействия IL­1_b увеличивается более чем в 30 раз и достигает уровня 167 нг/мл [4]. Ингибитором продукции CCL20/MIP­3a является дексаметазон [32].

Считалось, что эпителиальные клетки секретируют CCL20/MIP­3a, как и дефензины, преимущественно с базолатеральной стороны в местах тесного контакта, а в апикальной области секретируют TNF­a [13]. Однако в последующих исследованиях было показано, что локализация секреции CCL20/MIP­3a в значительной степени зависит от условий и характера индуцирующего стимула. Так, при TLR­ассоциированном возбуждении секреция CCL20/MIP­3a эпителиоцитами осуществляется через апикальную поверхность мембраны. Это необходимо, вероятно, для реализации антимикробного действия данного хемокина, так как апикальная форма высвобождения предполагает более выраженное воздействие на патоген, локализующийся на поверхности слизистой оболочки респираторного тракта. Но ответное высвобождение CCL20/MIP­3a с апикальной поверхности эпителиоцитов не является универсальным для агонистов всех TLR. Например, в ответ на действие агонистов TLR7 и TLR9, локсорибина и CpG мотивы бактериальной ДНК, CCL20/MIP­3a секретируется преимущественно с базолатеральной поверхности эпителиальных клеток, в то время как под влиянием индуцирующего действия цитокинов, в частности IL­17, эпителиоциты респираторного тракта секретируют CCL20/MIP­3a исключительно с базолатеральной поверхности клетки [18].

Противоинфекционное действие CCL20/MIP­3a

T.D. Starner и соавт. [4] в 2003 году показали, что CCL20/MIP­3a, индуцибельно продуцированный эпителиоцитами респираторного тракта, обладает антибактериальной активностью, которая зависит от концентрации ионов натрия и хлора в микроокружении.

Как и у большинства антимикробных пептидов, противобактериальное действие CCL20/MIP­3a связано с его высокой катионной активностью. Электростатический профиль молекулы CCL20/MIP­3a характеризуется полюсно расположенными регионами, которые несут положительный и отрицательный заряд. Так, большая часть поверхности белка CCL20/MIP­3a, организованная 40 петлями в С­терминальной области, обладает положительным зарядом, в то время как значительная часть N­терминального региона молекулы несет отрицательный заряд. Наличие региона с положительным зарядом является необходимым условием для осуществления антибактериального действия CCL20/MIP­3a, так как он позволяет протеину связываться с отрицательно заряженной поверхностью стенок бактерий. Также катионный домен CCL20/MIP­3a участвует в противовирусной защите от вируса коровьей оспы и респираторно­синцитиального вируса. Однако протеин CCL20/MIP­3a не активен в отношении вируса простого герпеса типа 1, вирусная оболочка которого не имеет отрицательного заряда. Недавно было показано, что фрагмент C­терминального региона пептида CCL20/MIP­3a, состоящий из 12 аминокислотных остатков, обладает не менее выраженной антимикробной активностью, чем полновесная молекула [10, 26, 27].

Хемокин CCL20/MIP­3a проявляет достоверную антибактериальную активность против широкого спектра бактерий, преимущественно против грам­отрицательных бактерий, в частности против Enterococcus faecium, Escherichia coli, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, а также обладает противовирусной и фунгицидной активностью против Candida albicans. Было показано, что CCL20/MIP­3a обладает более высокой антимикробной активностью против Escherichia coli ATCC 25922 и Staphylococcus aureus ATCC 29213, чем HBD1 и HBD2 [12, 26, 27, 36]. Предполагают, что хемокин CCL20/MIP­3a играет ключевую роль в активации NKT­клеток, обеспечивающих эрадикацию возбудителя, при туберкулезе легких [14].

Показано, что CCL20/MIP­3a ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека [3].

Иммуномодулирующее действие CCL20/MIP­3a

Протеин CCL20/MIP­3a, как хемокин, реализует свое действие через активацию хемокинового CC семитрансмембранного GPC рецептора­6 (CCR6) [8, 33, 38]. Было показано, что непосредственно c CCR6 могут взаимодействовать не только CCL20/MIP­3a, но и дефенсины HBD2, параллельно индуцируя хемотаксис CCR6­экспрессирующих клеток. Сравнение молекулярных структур показало, что протеины b­дефенсин­2 и CCL20/MIP­3a имеют подобные топологические мотивы. Мотив Asp⁴–Leu⁹ молекулы HBD2 напоминает мотив Asp⁵–Leu⁸ молекулярной последовательности CCL20/MIP­3a, который считается ответственным за взаимодействие с рецептором CCR6 [15].

Хемокин CCL20/MIP­3a обладает выраженной специфичностью и очень высоким аффинитетом к своему единственному рецептору CCR6. Степень аффинитета протеина CCL20/MIP­3a, учитывая, что он может существовать как в мономерной, так и в димерной форме, зависит от меримизации. Известно, что средний размер взаимодействующей расщелины димера составляет 12.1 Å — достоверно больше, чем у мономера CCL20/MIP­3a. David I. Chan и соавт. [10] считают, что эта разница в размерах расщелины может быть одной из причин, объясняющих почему мономерный хемокин обладает значительно более высоким аффинитетом к рецептору, чем его димерная форма. Также димер CCL20/MIP­3a перед взаимодействием с рецептором должен пройти некоторые конформационные изменения, в результате которых происходит высвобождение N­терминального региона молекулы.

Ген, кодирующий CCR6, находится на хромосоме­6, в то время как гены других хемокиновых b­рецепторов сосредоточены на хромосоме 3 [28].

Рецептор CCR6 экспрессируется на незрелых CD34⁺ дендритных клетках, но не на моноцитарных дендритных клетках, а также на В­лимфоцитах и клетках некоторых субпопуляций Т­лимфоцитов, в том числе клетках памяти 45RO⁺, Th17 и регуляторных (Treg) клетках [5]. Функционально активные рецепторы CCR6 в большей степени экспрессируются на CD4⁺Т­клетках слизистой оболочки носа, трахеобронхиального дерева и кожных покровов, чем на CD4⁺Т­клетках периферической крови [16].

Экспрессия CCR6 также была идентифицирована в лимфатической и нелимфатических тканях селезенки, вилочковой железы, лимфатических узлов, толстого и тонкого кишечника, поджелудочной железы, печени и яичек [21].

По всей вероятности, CCL20/MIP­3a активирует рецепторную субъединицу Gbg, которая индуцирует фосфолипазу C и фосфатидилинозитольную киназу 3, что приводит к возбуждению регуляторных киназ FAK и Pyk­2 цитоскелета, обусловливающих хемотаксис клеток [6, 11]. Эпителиоциты после взаимодействия с PAMP патогенов активно продуцируют CCL20/MIP­3a, взаимодействие которого с CCR6 незрелых дендритных клеток, Т­лимфоцитов, В­лимфоцитов обусловливает миграцию данных клеток в регион поражения слизистой оболочки респираторного тракта. CCL20/MIP­3a также способствует созреванию дендритных клеток и дальнейшей презентации антигена Т­клеткам [12, 19, 20, 35, 41].

Экспрессия CCR6 Th₁₇­ и Treg­клетками играет важнейшую роль в процессе их миграции в регион воспаления. Дифференцировка наивных CD4⁺ Т­клеток в Th₁₇­клетки опосредована активирующим влиянием TGF­b и IL­6 на факторы транскрипции STAT3, RORgt, и RORa, участвующие в активации генов CCR6 и CCL20/MIP­3a. Экспрессия CCR6 на поверхности мембран Th₁₇­ и Treg­клеток не только поддерживает их взаимоотношения данных Т­лимфоцитарных субпопуляций, но и имеет биологическое значение в координации процессов транслокации про­ и противовоспалительных Т­клеток. Было продемонстрировано [7], что в ответ на действие CCL20/MIP­3a, который был продуцирован активированными эпителиоцитами, Th₁₇­ и Treg­клетки CCR6­зависимым образом мигрируют к месту поражения инфекционными агентами. Tomohide Yamazaki и соавт. [7] предполагают, что провоспалительные Th₁₇­клетки первой волны, достигнув ткани­мишени, реактивируют местные антигенпрезентирующие клетки и начинают активно секретировать IL­17, который индуцирует секрецию CCL20/MIP­3a разнообразными типами клеток. Увеличение общего объема продукции CCL20/MIP­3a способствует организации второй, более мощной волны миграции Th₁₇­клеток, усиливая активность процесса воспаления. Однако CCL20/MIP­3a привлекает и CCR6­экспрессирующие Treg­клетки, которые представляют особую гетерогенную субпопуляцию иммунных клеток, обладающих ингибирующим действием на механизмы воспалительного и аутоиммунного процессов. В результате нарушения взаимодействия CCL20/MIP­3a с CCR6­экспрессирующими Th₁₇­ и Treg­клетками может измениться баланс Th₁₇­ и Treg­клеток в очаге поражения с неоднозначностью своих последствий [7].

Протеин CCL20/CCR6 играет важнейшую роль в патогенезе многих аллергических и аутоиммунных заболеваний. По мнению Seddon Y. Thomas и соавт. [29], не изменения в балансе Th₁/Th₂­цитокинов, а нарушение активности CCR6 предопределяет развитие бронхиальной астмы, ревматоидного артрита, псориаза.

Показано, что CCR6(+)­дендритные клетки рекрутируются в региональные лимфатические узлы и активируют местные антигенспецифические Т­клетки, в то время как CCR6(–)­дендритные клетки не в состоянии ответить на инфицирование организма и не индуцируют Т­клеточное возбуждение. Таким образом, недостаточное напряжение оси CCL20/CCR6 воспалительного процесса приводит к снижению Т­клеточноопосредованного контроля эрадикации возбудителя [9].

Увеличение экспрессии CCR6 и продукции CCL20/MIP­3a после провокации аллергенами свидетельствует о том, что возбуждение CCL20/MIP­3a рецептора CCR6 может потенциально увеличить пролиферацию клеток памяти и предопределить развитие аллергического воспаления [16].

Протеин CCL20/MIP­3a обладает таким выраженным индуцирующим действием на механизмы клеточного и гуморального противовирусного ответа, что, по мнению Joan Tarradas и соавт. [22], Satoru Kodama и соавт. [24], может быть рекомендован для использования в качестве вакцинального адъюванта.

Другие действия CCL20/MIP­3a

Было показано, что взаимодействие CCL20/MIP­3a с CCR6 эпителиальных NCI­H292, но не NHBE, клеток слизистой оболочки респираторного тракта пациентов с хроническими обструктивными заболеваниями легких индуцирует продукцию муцина MUC5AC, реактивируя EGFR через TACE (metalloprotease TNF­a­converting enzyme)­зависимый путь [23]. У мышей с нокаутным геном CCR6 при инфицировании респираторно­синцитиальным вирусом отмечается развитие менее выраженной гиперреактивности бронхиального дерева, продукции слизи и скудное рекрутирование Т­клеток в слизистую оболочку респираторного тракта в сочетании с низким уровнем продукции Th₂­ассоциированных цитокинов [5].

Кроме участия в хемотаксисе, система CCL20/CCR6 играет важную физиологическую роль в репарации слизистой оболочки толстого кишечника [21]. Показано, что стимуляция эпителиоцитов CCR6 слизистой оболочки толстого кишечника приводит к мобилизации внутриклеточного кальция, активации RhoA, фосфорилированию F­актина и легких цепей миозина, что обусловливает направленную миграцию энтероцитов [40]. Нельзя исключить, что протеин CCL20/MIP­3a участвует и в репарации слизистой оболочки респираторного тракта.

Заключение

Хемокин CCL20/MIP­3a является полифункциональной биологически активной молекулой. В респираторном тракте протеин CCL20/MIP­3a функционирует и как антимикробный пептид, действующий на грамположительные и грамотрицательные бактерии, и как хемокин, привлекающий незрелые дендритные клетки, В­ и Т­лимфоциты в место поражения респираторного тракта, и, возможно, как протеин, участвующий в репарации слизистой оболочки. Состояние системы CCL20/CCR6 если не в большей, то определенно не в меньшей степени, чем баланс Th₁/Th₂­клеток, предопределяет характер развития воспаления в респираторном тракте.