Журнал «Здоровье ребенка» 7 (34) 2011

В рамках сучасного підходу до дослідження механізмів розвитку токсикозу при інфекційних захворюваннях у дітей дуже перспективним є вивчення ендотоксинемії, пов’язаної з підвищеним проникненням ендотоксину (ЕТ) з кишечника в системний кровотік [1, 2]. Так, було показано, що в гострому періоді бактеріальних ангін і скарлатини у дітей розвивається ендотоксинемія кишкового походження, вираженість якої залежить від тяжкості основного захворювання [3]. Внаслідок цього токсемія, викликана дією збудників ангіни і скарлатини, може підсилюватися в результаті розвитку патофізіологічних реакцій, що запускаються ЕТ. Відомо, що ЕТ реалізує свої ефекти, зв’язуючись із різними клітинами макроорганізму [4]. Зокрема, моноцити/макрофаги експресують мембранний CD14­рецептор (мCD14), компонент рецепторного комплексу CD14/TLR4/MD2, що розпізнає ЕТ. На окремих гранулоцитах також виявляються рецептори мCD14, однак вони експресуються слабко. Крім того, існує розчинна форма CD14­рецептора (рCD14), що секретується в кров макрофагами і моноцитами [5, 6]. ЕТ, що являє собою ліпополісахарид (ЛПС), взаємодіє з ЛПС­зв’язуючим білком (ЛСБ) і розчинною формою CD14, після чого комплекс ЛПС­ЛСБ зв’язується з мCD14 на поверхні макрофагів. Оскільки мCD14 не має внутрішньоклітинного сигнального домену, то клітинна відповідь на ЛПС залежить від трансмембранного Toll­like­рецептора (TLR), а саме TLR4 [6, 7]. Проведення активаційного сигналу, після зв’язування ЛПС, служить поштовхом до початку експресії генів цитокінів, NO­синтази і генів інших медіаторів, ферментів і регуляторних молекул запалення. У результаті відбувається активація всіх основних клітинних функцій, пов’язаних із розвитком фагоцитозу і представленням антигенів, продукцією NO і вільних форм кисню, синтезом низькомолекулярних медіаторів запалення і групи прозапальних цитокінів, до яких належать інтерлейкіни — ІЛ­1, ІЛ­6, ІЛ­18, фактор некрозу пухлин, інтерферони I типу, хемокіни. Одночасно активуються цитокіни, що стимулюють диференціювання Т­лімфоцитів­хелперів I типу — ІЛ­12, ІЛ­23, ІЛ­27. У свою чергу, цитокіни відіграють провідну роль в індукції відповіді гострої фази запалення [5, 8–10]. Таким чином, динаміка клітинної активації, пов’язаної з розвитком ендотоксинемії, залежить від рівня експресії мCD14 моноцитами/макрофагами, який, у свою чергу, визначає динаміку синтезу ряду медіаторів запалення, а значить, і вираженість запальної відповіді.

Метою дослідження стало визначення щільності експресії рецептора CD14 на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові у дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину, залежно від рівня ендотоксинемії кишкового походження.

Матеріал і методи дослідження

Обстежені 90 хворих віком від 2 до 6 років, які перебували на лікуванні в КРУ «Дитяча інфекційна клінічна лікарня» м. Сімферополя за період з 2005 по 2008 рр.

Всі обстежені діти були розподілені на 4 групи. До 1­ї групи ввійшли 34 хворі на бактеріальну ангіну середнього ступеня тяжкості, до 2­ї групи — 29 хворих із тяжкою формою ангіни, 3­тю групу становили 15 хворих із середньотяжкою формою скарлатини, до 4­ї групи увійшли 12 хворих із тяжкою формою скарлатини, причому тяжкість була зумовлена розвитком бактеріальних ускладнень (синуситу, лімфадениту, отиту, паратонзиліту) і метаболічних розладів. Матеріалом дослідження служила периферична кров, що забиралась у гострому періоді захворювання (при надходженні до стаціонару і на 2­гу — 3­тю добу перебування) та перед випискою зі стаціонару.

Групу порівняння становили 25 здорових дітей віком від 2 до 6 років.

Рівень експресії рецептора CD14 моноцитами і гранулоцитами периферичної крові визначали методом проточної лазерної цитофлуориметрії, використовуючи як флуоресцентно мічений ліганд кон’югат ЛПС E.coli K235 із флуоресцеїнізотіоціанатом і моноклональні антитіла (МКА) до антигену CD14, мічені фікоеритрином [11]. Для аналізу результатів використовували програмне забезпечення Partec FloMax V, 2,4d (Partec GmbH, Munster, Germany). Результат виражали в умовних одиницях флюоресценції (ум.од.фл.).

Визначення кількісного вмісту ендотоксину в сироватці крові хворих здійснювали методом хромогенного аналізу за кінцевою точкою: після змішування ЛАЛ­реактиву Endosafe^® Endochrome з досліджуваним зразком вимірювали жовте забарвлення, що розвивається в реакційній суміші, за допомогою спектрофотометра, при довжині хвилі 405–410 нм [3, 12]. Інтенсивність забарвлення була прямо пропорційна вмісту ендотоксину в зразку. Концентрацію ендотоксину в зразку визначали за калібрувальною кривою, а результат виражали в міжнародних одиницях ендотоксину/мл (МОЕ/мл).

Результати досліджень та їх обговорення

Як видно з табл. 1, показник експресії мембранного CD14­рецептора на моноцитах при надходженні в стаціонар підвищувався у групах хворих на ангіни як середньої, так і тяжкої форм (1­ша, 2­га групи) на 21 і 53 % відповідно (р < 0,05 — р < 0,001) порівняно з групою здорових дітей. При цьому показник у хворих із тяжкою формою ангіни на 26 % перевищував показник хворих із середньотяжкою формою (р₂ < 0,01). У хворих на скарлатину (3­тя, 4­та групи) рівень експресії мCD14 також підвищувався на 37–42 % відповідно (р < 0,001), але при цьому вірогідно не залежав від ступеня тяжкості (р₂ > 0,2). Така динаміка мCD14­рецептора у хворих усіх 4 груп цілком закономірна, оскільки на цьому ж етапі дослідження рівень ЕТ в сироватці крові був підвищений [3].

Показники експресії мCD14, одержані у хворих із середньотяжкими формами ангін і скарлатини до 3­го дня перебування у стаціонарі, виявились схожими з результатами при надходженні. Рівень експресії мCD14 залишався підвищеним (р < 0,01) і вірогідно не відрізнявся від показника при надходженні, при цьому він узгоджувався з підвищеною концентрацією ЕТ у сироватці крові хворих на цьому етапі досліджень.

У той же час у хворих із тяжкими формами захворювань (2­га і 4­та групи) на тлі збільшення концентрації ЕТ вдвічі показник рецепторної експресії на моноцитах, навпаки, помірно знижувався на 11–19 % відповідно (р₁ < 0,05) порівняно з показником при надходженні, залишаючись при цьому вірогідно вище фізіологічної норми. Зниження щільності експресії рецептора у хворих цих груп може бути зумовлене розвитком функціональної неспроможності моноцитів в умовах надлишкової стимуляції мембранних рецепторів ендотоксином [10].

 Відомо, що стимулюючий ефект на мононуклеарні фагоцити справляють лише низькі дози ЕТ, тоді як більш високі, навпаки, блокують їх основні функції [13]. Також є наукові дані про те, що в умовах ендотоксинемії порушується передача внутрішньоклітинного сигналу та змінюється цитоскелет моноцитів/макрофагів, що призводить до функціональної неповноцінності фагоцитів і їх депресії [14–16].

Із результатів наших досліджень видно, що щільність експресії мCD14, що прямо залежить від рівня ендотоксинемії в сироватці крові хворих, непрямо пов’язана з тяжкістю перебігу основного інфекційного захворювання. Так, хоча концентрація ЕТ у сироватці крові мала тенденцію до наростання у хворих усіх 4 груп, у хворих із тяжкими формами ангін і скарлатини вона була у 2 рази вищою, ніж у хворих із середньою тяжкістю, що призводило до порушення функціональної здатності моноцитів експресувати мCD14 у хворих із тяжкими формами захворювання.

Потрібно зазначити, що, з одного боку, зниження здатності моноцитів експресувати мCD14 при тяжкому перебігу інфекційного захворювання може призвести до зриву імунної відповіді, починаючи з неадекватного синтезу медіаторів запалення і закінчуючи порушенням антитілопродукції, що небезпечно в плані розвитку ускладнень і можливої генералізації інфекційного процесу. З іншого боку, цей феномен може бути неспецифічним захисним механізмом, що має за мету попередження розвитку неконтрольованого запального каскаду, так званої медіаторної бурі, внаслідок якої розвиваються шок і поліорганна недостатність. Більшість досліджень, що свідчать про негативний вплив зниження щільності експресії мCD14, були проведені у хворих, які перебували у критичному стані. Зокрема, установлено, що значне зниження щільності експресії мCD14 на моноцитах у хворих із тяжкими пневмоніями та сепсисом прямо залежало від летального наслідку захворювання [17, 18]. Крім того, доведено, що зниження експресії мCD14 і фагоцитарної активності моноцитів/макрофагів пов’язане і зі зростанням ризику розвитку бактеріальних ускладнень у хворих [19, 20]. Ґрунтуючись на даних наукової літератури і результатах наших досліджень, можна зробити висновок, що помірне зниження щільності мCD14 рецептора на моноцитах у гострому періоді перебігу тяжкого інфекційного захворювання може виконувати компенсаторну роль, тоді як значне зниження експресії мCD14 свідчить про декомпенсацію механізму клітинної активації, є патологічним, що веде до повного зриву імунної відповіді і, як наслідок, можливо, до фатального наслідку захворювання.

На час виписки зі стаціонару рівень експресії CD14­рецептора на моноцитах відповідав фізіологічним показникам у більшості хворих, за винятком хворих із тяжкою формою скарлатини, у яких він залишався вище норми на 16 % (р < 0,02).

Аналізуючи динаміку експресії CD14­рецептора гранулоцитами, ми враховували первісно слабку здатність гранулоцитів на відміну від моноцитів експресувати CD14­рецептор [5]. На момент надходження в стаціонар у хворих 1–4­ї груп рівень експресії мCD14­рецептора підвищувався в середньому на 17–27 % (р < 0,01 — р < 0,001), вірогідно не відрізняючись залежно від ступеня тяжкості захворювання.

На 3­й день перебування в стаціонарі під час найбільш вираженої ендотоксинемії показник експресії мCD14 у хворих на ангіни (1­ша і 2­га групи) залишався підвищеним (р₁ < 0,05 — р₁ < 0,01) і вірогідно не відрізнявся від показника при надходженні. У той же час у хворих на скарлатину (3­тя і 4­та групи) він відповідав рівню здорових дітей.

На момент виписки зі стаціонару рівень експресії CD14­рецептора на гранулоцитах у хворих усіх 4 груп не відрізнявся від фізіологічного.

Таким чином, нами вперше виявлено, що у відповідь на підвищення рівня ендотоксину кишкового походження в системному кровотоку хворих на бактеріальні ангіни та скарлатину збільшувалась щільність експресії CD14­рецепторів на моноцитах периферичної крові, рівень якої прямо залежав від тяжкості захворювання. У гострому періоді хвороби при наростанні концентрації ЕТ в сироватці крові хворих із тяжкими формами рівень експресії мCD14­рецепторів помірно знижувався, що свідчило про пригнічення механізмів клітинної активації в умовах вираженої ендотоксинемії. Щільність експресії CD14­рецепторів на гранулоцитах периферичної крові хворих на ангіни та скарлатину при розвитку ендотоксинемії теж підвищувалась, однак через низьку здатність гранулоцитів експресувати мCD14 результати були не такі показові.

Висновки

1. Підвищення рівня ЕТ кишкового походження в сироватці крові дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину, супроводжується збільшенням експресії CD14­рецептора на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові в гострому періоді захворювання, що може підсилювати активність запального процесу й вираженість інфекційного токсикозу.

2. Установлена залежність між тяжкістю інфекційного процесу та ендотоксинзалежною активацією експресії мCD14 на моноцитах периферичної крові хворих.

3. Виявлено, що функціональна здатність моноцитів до експресії мCD14 пригнічується у хворих із тяжкими формами ангін і скарлатини в умовах розвитку вираженої ендотоксинемії, при цьому помірне зниження щільності експресії мCD14, очевидно, виконує компенсаторну роль, попереджуючи розвиток «медіаторної бурі», а значне може бути ознакою декомпенсації та свідчити про зрив імунної відповіді та небезпеку фатального наслідку хвороби.