Журнал «Здоровье ребенка» 7 (34) 2011

Сокращения: АКМ — активные кислородосодержащие метаболиты; AMП (antimicrobial peptide) — антимикробные пептиды; HBD (human b­defensins) — человеческий b­дефензин; HD (human defensin) — человеческий a­дефензин клеток Панета; HNP (human neutrophils peptide) — человеческий нейтрофильный пептид, нейтрофильный a­дефензин; LPS (lipopolysaccharide) — липополисахарид; NLR (NOD­like receptor) — Nod­подобные рецепторы; PAMP (pathogen­associated molecular pattern) — патоген­ассоциированные молекулярные структуры; TLR (Toll­like receptor) — Toll­подобные рецепторы.

Введение

Механизмы местной неспецифической защиты респираторного тракта, включающие в себя непрерывный эпителиальный слой, реснитчатый аппарат эпителия, альвеолярные макрофаги, нейтрофилы, моноциты, макрофаги, системы пероксидазы, сурфактанта, комплемента, антимикробных пептидов, в отличие от механизмов специфического иммунного ответа активируются сразу после внедрения различных патогенных микроорганизмов, обеспечивая первую линию противоинфекционной обороны организма [25, 168, 172, 234].

Общие данные об антимикробных пептидах

Продукция белковых молекул, обладающих выраженной антимикробной активностью, является одним из наиболее древних механизмов неспецифической защиты макроорганизма от инвазии инфекционными патогенами. Среди этих молекул условно выделяют два больших молекулярных класса: рибосомально синтезируемые олигопептиды и протеины, которые представлены у всех видов многоклеточных организмов, и нерибосомально синтезируемые пептиды, которые продуцируются бактериями и грибами, в частности бацитрацин, грамицидин S, полимиксин В, ванкомицин, тейкопланин. Наиболее яркими и эффективными молекулярными компонентами неспецифических механизмов защиты организма являются антимикробные пептиды (АМП). Термин «антимикробные пептиды» обычно используется для обозначения защитных пептидов эукариотов [84, 95, 258].

Антимикробные пептиды — это маленькие амфифильные (то есть имеющие гидрофильную и гидрофобную части) молекулы, состоящие всего из 12–50 аминокислотных остатков, с выраженным бактерицидным действием. АМП представляют эволюционно наиболее древнюю противоинфекционную систему, которая эффективно противодействует, преимущественно на эпителиальных поверхностях слизистых оболочек и кожных покровов, широкому кругу патогенных бактерий, грибов и вирусов [30, 84, 95, 258].

В настоящее время в базу данных АМП внесено 1393 антимикробных, 103 противовирусных, 553 противогрибковых пептида [http://aps.unmc.edu/AP/database/antiF.php]. У млекопитающих идентифицировано более 500 различных АМП [257]. Различают пять классов АМП — анионные, катионные пептиды, линейные амфифильные a­спиральные пептиды, пептидные фрагменты и пептиды, обогащенные цистеиновыми аминокислотными остатками (табл. 1) [94, 126, 160].

Основным местом расположения АМП являются поверхность эпителиальных клеток слизистых оболочек, кожных покровов, азурофильные гранулы нейтрофилов, клетки Панета [95, 254, 258]. Продукция АМП может быть как конститутивной, так и индуцибельной. Синтез АМП индуцируется преимущественно патоген­ассоциированными молекулярными структурами (РАМР) инфекционных агентов и цитокинами (IL­1b, IL­8/CXCL8, TNF­a и другими), которые реализуют свое действие через TLR, NLR и цитокиновые рецепторы соответственно [37, 52]. Ведущую роль в индуцибельном обеспечении АМП играет РАМР­ассоциированная TLR­ и NLR­зависимая продукция [83]. В индукции синтеза АМП могут принимать участие и некоторые аминокислоты, в частности L­изолейцин [139]. Pascale Fehlbaum и соавт. [74] считают, что увеличение концентрации свободного изолейцина, который может иметь как бактериальное происхождение, так и быть продуктом протеолиза белков макроорганизма бактериальными ферментами, приводит к возбуждению специфического, возможно, внутриклеточного рецептора. Данный рецептор активирует семейство факторов транскрипции NF­kB/rel, ответственных за инициацию синтеза провоспалительных цитокинов и АМП.

Противомикробную защиту АМП осуществляют с помощью неокислительного киллинга бактерий [254]. Тонкие механизмы киллинга бактерий окончательно не установлены. Бактерицидная активность АМП достоверно зависит от особенностей строения и состояния бактериальной стенки, уровня амфифильности молекулы, значений pH окружающей среды, местной концентрации АМП и NaCl [38, 103, 156, 218, 255].

Из множества предложенных моделей бактерицидного действия АМП несмотря на свою двадцатилетнюю историю, модель Шайа — Мацузаки — Хуанга (Shai — Matsuzaki — Huang), вероятно, наиболее соответствует современным представлениям об электростатических и пространственных взаимодействиях антимикробных пептидов с мембраной инфекционных агентов. Согласно модели Шайа — Мацузаки — Хуанга, взаимодействие АМП с бактериальной мембраной представляет три последовательных шага. Это кумуляция молекул дефензина на внешней поверхности бактериальной мембраны за счет электростатических взаимосвязей, проникновение АМП в липидный бислой мембраны и дестабилизация мембраны с нарушением ее целостности. Клеточная стенка бактерий хорошо проницаема не только для питательных веществ, но и для таких маленьких молекул, как АМП. Положительный заряд молекулы АМП способствует возникновению электростатической взаимосвязи между АМП с такими отрицательно заряженными поверхностными компонентами мембраны, как липополисахариды (LPS) грамотрицательных бактерий и тейхоевые кислоты, липотейхоевые кислоты и лизилфосфатидилглицерол грамположительных бактерий (рис. 1) [261].

Молекулы АМП, взаимодействуя с поверхностными структурами бактерии, приобретают правостороннюю спиральную форму, которая пред­определяет их проникновение вглубь отрицательно заряженного фосфолипидного слоя мембраны бактерии, нарушая ее целостность и/или блокируя метаболизм бактериальной клетки (рис. 2) [13, 93, 205].

Любые амфифильные молекулы, в том числе и АМП, при том что они одновременно содержат гидрофобные и гидрофильные группы, отличаются, особенно в биологических средах, дуальностью поведения. Взаимодействие гидрофильных групп с молекулами водной среды ведет к однонаправленному расположению молекул АМП, а стремление гидрофобных групп к увеличению числа контактов друг с другом обусловливает образование сложных макромолекулярных структур, в частности каналоподобных структур. При организации стенок поры только из молекул АМП возникает трасмембранный канал, который по форме напоминает цилиндрическую бочку, а организация стенок поры из комбинации АМП и липидных компонентов мембраны бактерии ведет к образованию тороидальной поры (рис. 3) [249].

Образование пор в бактериальной мембране по модели «деревянных бочек» характерно для немногих представителей семейства АМП, в частности для аламетицина — АМП гриба Trichoderma viride. Аминокислотная последовательность аламетицина состоит из 20 аминокислотных остатков (Ac­Aib­Pro­Aib­Ala­Aib­Ala­Gln­Aib­Val­Aib­Gly­Leu­Aib­Pro­Val­Aib­Aib­Glu­Glu­Phl) и включает необычные остатки — остатки a­аминоизобутирата. Аламетициновый канал образуется кластером из 6–11 молекул, соединенных стабилизирующими его структуру водородными связями. При данном варианте порообразования гидрофобные области пептида взаимодействуют с ацильными группами липидов мембраны бактерий, а его гидрофильные области формируют внутреннюю поверхность канала поры, длина которого (32 Å) позволяет пересечь мембранный бислой бактерии [249]. Согласно тороидальной модели порообразования, АМП пронизывают мембрану бактерии, плотно прилегая друг к другу, взаимодействуют с ее липидными структурами и, выстраиваясь по кругу перпендикулярно плоскости бактериальной мембраны, образуют тороидальную пору [81, 203].

Поры, образованные АМП, в отличие от мембраны бактерии не обладают селективностью по отношению к проницаемости ионов различных электролитов и не поддерживают градиент осмотического давления. При достижении критической величины количества пор, пронизывающих мембрану, бактериальная клетка погибает от осмотического шока. Joseph I. Kourie считает, что образующиеся поры функционируют как неселективные ионные каналы и АМП могут непосредственно взаимодействовать с транспортными белками клеточной мембраны, изменяя трансмембранную проницаемость, которая обусловливает прогредиентную дисминерализацию клетки [157].

Согласно «ковровой» теории, положительно заряженные молекулы АМП разрывают отрицательно заряженную мембрану клетки микроорганизма [96]. В результате множественных нарушений целостности мембраны бактерии погибают [157].

Однако последние исследования показали, что пертурбации бактериальной мембраны являются важными, но не единственными АМП­индуцируемыми событиями, которые приводят бактерии к гибели (рис. 4) [78, 145]. Установлено, что АМП активируют внутриклеточные механизмы гибели микроорганизмов [167, 251]. Некоторые АМП проникают в цитоплазму бактерии и нарушают функционирование ДНК и РНК. Так, нейтрофильный бычий бактенецин, богатый аргинином АМП, нарушает функцию РНК, а цекропин (PR­39) ингибирует синтез ДНК в грамотрицательных бактериях. Такие АМП, как магаинин II, индолицидин, темпорины (B и L), изменяют активность фосфолипазы А₂ [260].

Процесс фагоцитоза инфекционных агентов сопровождается выраженным синтезом АМП. Помимо осуществления непосредственного бактерицидного действия, антимикробные пептиды активируют другие механизмы антибактериальной защиты организма. Практически все АМП увеличивают мощность генерации активированных кислородосодержащих метаболитов (АКМ) [48], которые не только обладают антимикробным действием, но и являются сигнальными молекулами, активирующими экспрессию генов провоспалительных цитокинов [151].

Кроме антимикробной функции, АМП обладают выраженным иммуномодулирующим действием [29, 214]. Большинство АМП модулируют TLR­зависимое возбуждение PAMP инфекционных агентов [33]. АМП оказывают хемотаксическое действие (дефензины, кателицидин) на различные провоспалительные клетки [95, 128, 185, 191], индуцируют апоптоз (кателицидин, лактоферрицин), способствуют репарации тканей (дефензины, кателицидин) [11, 198]. АМП играют ключевую роль в организации взаимосвязи неспецифических механизмов защиты и адаптивной иммунной системы организма [45].

АМП также индуцируют синтез факторов роста [11, 66, 77, 235], ингибируют продукцию протеаз [216], эндостатинов [67].

У человека катионные АМП, функционирующие в респираторном тракте, представлены двумя основными молекулярными семействами, которые организованы дефензинами и кателицидином (LL­37) [28, 71, 258].

Краткая характеристика семейства дефензинов

Дефензины, ранее известные как лизосомальные катионные протеины, являются наиболее эволюционно древними пептидами, которые участвуют в неспецифической защите макроорганизма от инфекционных агентов. Нарастающий из года в год научный интерес (рис. 5) к биологическому и медицинскому значению дефензиновых пептидов и чрезвычайно высокая степень изменчивости их генов по праву позволяют считать их молекулами, переживающими ренессанс [107].

Впервые дефензины млекопитающих были описаны в 1956 году Robert C. Skarnes и Dennis W. Watson [220] как лейкины и James G. Hirsch [105] как фагоцитины полиморфноядерных лейкоцитов кролика. В серии работ H.I. Zeya и John K. Spitznagel [259] показали, что данные протеины относятся к одному молекулярному семейству, которое они определили как семейство катионных антимикробных протеинов, и только в 1985 году Michael E. Selste и соавт. [193] дали им современное название — дефензины.

Человеческие дефензины представляют собой семейство амфифильных, катионных, богатых цистеиновыми остатками пептидов с молекулярной массой 3–4 кД, молекула которых состоит из 29–47 аминокислотных остатков [1, 85, 86, 181].

Молекулы дефензинов отличаются высоким содержанием положительно заряженных аргининовых, лизиновых остатков, аминокислот с гидрофобными боковыми группами и обязательным наличием шести цистеиновых остатков, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика, которые функционально стабилизируют молекулу от деградации протеазами. В настоящее время идентифицировано три типа дефензинов: a­дефензины, b­дефензины и q­дефензины (табл. 2). У человека обнаружены a­дефензины и b­дефензины. Циклические q­дефензины обнаружены только у макаки­резус (Macaca mulatta). Из­за короткой аминокислотной последовательности (18 аминокислотных остатков) q­дефензины получили альтернативное название — минидефензины. Показано, что у человека экспрессируются мРНК q­дефензинов, но так как человеческие гены (DEFT) q­дефензинов содержат в сигнальном регионе гена стоп­кодон, который прерывает трансляцию, соответствующие пептиды в человеческом организме не синтезируются [3, 202, 211, 214]

Молекулы различных классов дефензинов отличаются длиной аминокислотных последовательностей и аранжировкой дисульфидных связей. Аминокислотная последовательность молекул дефензинов характеризуется двумя формулами, которые характерны для a­ и b­дефензинов. Молекула a­дефензинов организована последовательностью xxCxCxxxxxCxxxxxxxGxCxxxxxxxxxCCxx, где х представляет разные аминокислотные остатки, а C — цистеиновые остатки, которые в данной аминокислотной последовательности связаны в позициях Cys¹­Cys⁶, Cys²­Cys⁴, Cys³­Cys⁵; молекула b­дефензинов — CxxxxxxCxxxxCPxxxxxxxxCxxxxx(х)CCxx, у которой цитеиновые остатки связаны в позициях Cys¹­Cys⁵, Cys²­Cys⁴, Cys³­Cys⁶ (рис. 6) [119, 150, 249].

Согласно данным рентгеновской кристаллографии, несмотря на разницу в аминокислотной последовательности, вторичная структура различных дефензинов удивительно похожа. Она представляет антипараллельный b­складчатый лист, который стабилизирован тремя внутримолекулярными дисульфидными связями (рис. 7) [2, 119, 232].

В 1980 году a­дефензины впервые были выделены в отдельную группу, которая в настоящее время представлена нейтрофильными, или миелоидными (human neutrophils peptides — HNP), a­дефензинами (HNP­1, HNP­2, HNP­3, HNP­4) и кишечными a­дефензинами клеток Панета (HD5, HD6). Нейтрофильные a­дефензины участвуют в антибактериальной защите, а a­дефензины, секретируемые клетками Панета, преимущественно управляют жизнедеятельностью микрофлоры кишечника [69, 207].

Содержание HNP­1, HNP­2 в азурофильных гранулах нейтрофилов человека значительно преобладает над количеством других a­дефензиновых пептидов [175, 207]. Пептиды HNP­1, HNP­2, HNP­3 состоят из 30, 29 и 30 аминокислотных остатков соответственно и высокогомологичны по аминокислотной последовательности. Молекулы этих пептидов отличаются всего лишь по одному аминокислотному остатку в N­терминальном регионе. Аминокислотная последовательность молекулы HNP­1 отличается наличием дополнительного остатка аланина, HNP­3 — наличием дополнительного остатка аспарагиновой аминокислоты. Аминокислотная последовательность пептида HNP­4 практически не гомологична пептидам HNP­1, HNP­2, HNP­3 и характеризуется наличием 33 аминокислотных остатков с высоким содержанием аргинина, который составляет 15,2 % от всей его молекулярной массы. Пептид HNP­4 обладает относительно высокой гидрофобностью [207].

В 1991 году Gill Diamond и соавт. [239] в ткани языка коровы был идентифицирован первый представитель b­дефензинов млекопитающих, который получил название «трахеальный антимикробный пептид» — TAP (tracheal antimicrobial peptide). В 1995 году Klaus W. Bensch и соавт. [102] из диализата гемофильтрата был выделен первый человеческий b­дефензин (HBD­1), молекула которого состояла из 36 аминокислотных остатков. В настоящее время субкласс b­дефензинов объединяет более 40 пептидов, которые являются ключевыми компонентами системы неспецифической противоинфекционной защиты слизистых оболочек респираторного, пищеварительного, урогенитального трактов и кожных покровов. Наиболее изучены 4 представителя b­дефензинов HBD­1, HBD­2, HBD­3, HBD­4 [144]. Пептидные представители субкласса b­дефензинов различаются по молекулярному строению и уровню положительного заряда. Так, пептид HBD­1 состоит из 36 аминокислотных остатков и характеризуется уровнем заряда +5, HBD­2 состоит из 41 аминокислотного остатка и поддерживает уровень заряда +7, HBD­3 содержит 45 аминокислотных остатков, поддерживает уровень заряда +11. Представляет интерес тот факт, что высокие уровни экспрессии мРНК HBD­3 регистрируются, как правило, в здоровых тканях макроорганизма [39, 154, 155].

Гены пептидного семейства дефензинов человека в основном расположены на хромосоме 8 (8p22‑23), но они также обнаружены на хромосомах 4, 6 и 20. Гены, кодирующие дефензины, которые экспрессируются исключительно в яичках, поджелудочной железе, почках и скелетных мышцах, находятся в двух кластерах на хромосоме 20. Продукты данных дефензиновых генов локализуются исключительно в местах синтеза и не транслоцируются в другие органы и ткани [59].

Было показано, что у людей наблюдается вариабельность числа копий генов дефензинов. Так, в геноме различных индивидуумов могут находиться от 2 до 15 копий генов DEFA1, DEFA3 и от 2 до 12 копий генов DEFB4, DEFB103A и DEFB104 [1, 49, 232]. Количество копий генов не всегда коррелирует с уровнем продукции пептидов. Примерно у 10–37 % пациентов, у которых наблюдается дефицит функционирования гена DEFA3, не наблюдается нарушений в работе местной защиты, которые приводили бы к развитию каких­либо инфекционно­воспалительных заболеваний [175].