Журнал «Здоровье ребенка» 3 (38) 2012

Хронічне захворювання нирок (ХЗН) є однією з актуальних проблем дитячої нефрології, воно призводить до втрати функції нирок та розвитку хронічної ниркової недостатності. Основною причиною виникнення ХЗН та розвитку хронічної ниркової недостатності в дитячому віці залишається хронічний гломерулонефрит. Достатньо часто перебіг хронічного гломерулонефриту в дітей характеризується стійкістю сечового синдрому, прогресуючим перебігом та ранньою інвалідизацією [1, 2].

Сучасний погляд на хронічний гломерулонефрит як одне з мультифакторних захворювань спонукає до вивчення нових предикторів виникнення та прогресування. Відомо, що розвиток гломерулонефриту безпосередньо пов’язаний з імунною активацією та системним запаленням [3], основу якого становить каскад біохімічних та імунологічних реакцій, що регулюються великою кількістю медіаторів, серед яких особливе місце займають цитокіни [4, 5]. До групи прозапальних цитокінів, яким надається особливо важливе значення в патогенезі гломерулонефриту, відносять інтерлейкін-1 (ІЛ-1). ІЛ-1 має широкий спектр локальних та системних ефектів, до яких у першу чергу належить активація Т- і В-лімфоцитів, індукція синтезу білків гострофазової відповіді, підвищення молекул адгезії. Окрім того, ІЛ-1 є тригерним чинником проліферації гломерулярних клітин, які відносять до пошкоджуючих факторів первинного ураження нирок, тобто названий цитокін дає можливість прогнозувати ступінь розвитку та прогресування хронічної ниркової недостатності у хворих із хронічним гломерулонефритом [6, 7]. Що стосується інтерлейкіну-10, то він синтезується моноцитами, Т- і В-лімфоцитами, пригнічуючи продукцію окремих Т-клітинних цитокінів (ІФН-g, ІЛ-4, ІЛ-5, ФНП-a) [8], активує В-лімфоцити щодо синтезу імуноглобулінів та як протизапальний чинник відіграє важливу роль у патогенезі гломерулонефриту [9]. Варіабельність рівня синтезу цитокінів залежить від генетичної детермінантності, тобто від наявності поліморфізму генів інтерлейкінів [10].

Установлено, що генетичні особливості продукції цитокінів, тобто поліморфізм генів цитокінів, визначають темпи й характер прогресування хронічного гломерулонефриту в дітей [12]. У сучасній літературі зустрічаються лише поодинокі дані про поліморфізм генів та зв’язок їх із перебігом захворювання, вплив на прогресування патології [10, 11]. Саме з цієї причини особливого значення набуває вивчення поліморфізму алельних варіантів генів цитокінів як основних медіаторів запалення при хронічному гломерулонефриті в дітей [13]. Наприклад, за даними проведених когортних досліджень, у хворих із ХЗН порівняно зі здоровими обстеженими генотип С/Т поліморфної ділянки гену ІЛ-1b (-511) асоціюється з прогредієнтним торпідним перебігом нефропатій [10], наявність генотипу С/Т поліморфної ділянки гену ІЛ-1b (-511) в геномі людини може розглядатися як один із факторів прогресування ХЗН.

Дослідження поліморфізму генів інтерлейкінів у дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, є перспективними у виявленні ранніх ознак та визначення груп ризику прогресування захворювання.

Метою нашого дослідження була оцінка поліморфізму алельних варіантів генів інтерлейкінів-10 та -1b в дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, та їх взаємозв’язок із показниками функції нирок.

Матеріали та методи

Нами обстежені 20 дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, із ХЗН І ст., без порушення функції нирок, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у нефрологічному відділенні Вінницької обласної дитячої лікарні. Перебіг захворювання у 8 (40,0 ± 10,9%) обстежених дітей мав ознаки торпідного із відсутністю позитивної динаміки клініко-лабораторних показників, незважаючи на патогенетичне лікування, а у 12 дітей (60,0 ± 10,9 %) спостерігалася часткова клініко-лабораторна ремісія зі збереженням стійкого сечового синдрому, але відсутністю набряків, нормалізацією або значним покращенням біохімічних показників.

Верифікація діагнозу хронічного гломерулонефриту проводилася згідно з наказом МОЗ України № 436 від 31.08.04 р. за спеціальністю «дитяча нефрологія». Усім хворим проведене комплексне обстеження, що включало клінічні (загальні аналізи сечі та крові, добова протеїнурія, проба за Нечипоренком, проба за Зимницьким), біохімічні (загальний білок та фракції, холестерин, сечовина, креатинін, сироваткове залізо, еритропоетин), імунологічні (кількісне визначення ІЛ-1b) методи дослідження, ультрасонографію нирок за допомогою апарата Toshiba SSD-220 (Японія) з оцінкою локалізації, форми, розмірів нирок, структури паренхіми, розмежування кіркового та мозкового шарів органа. Вираженість еритроцитурії визначали за результатами проби за Нечипоренком: при мінімальній еритроцитурії вміст еритроцитів не перевищував 10 ґ 10⁶/л, при помірній — становив від 10 ґ 10⁶/л до 60 ґ 10⁶/л, при вираженій — більше ніж 60 ґ 10⁶/л. Верхньою нормою лейкоцитів у сечі вважали 4,0 ґ 10⁶/л. Визначення швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ) проводилося розрахунковим методом за формулою Шварца. Стадії ХЗН визначали залежно від значень ШКФ та креатиніну крові згідно з наказом МОЗ України № 365 від 20.07.05.

Рівень сироваткового заліза визначали фотометричним методом (аналізатор Olympus) за допомогою стандартних наборів реактивів. У кислому середовищі зв’язане з трансферином залізо розпадається до іонів вільного заліза та апотрансферину. Далі під впливом кислот тривалентне залізо перетворюється у двохвалентне, іони двохвалентного заліза реагують із трипіридилтріазином, утворюючи сполуки блакитного кольору, які можна виміряти за допомогою біохроматичного методу. З метою кількісного визначення еритропоетину використовували твердофазний хемілюмінесцентний імуноферментний аналіз (сендвіч) на аналізаторі Immulite. Забір крові для дослідження проводився в першій половині дня, оскільки секреція еритропоетину в цей час найбільша. Рівень ІЛ-1b визначений методом ІФА (ELISA) за допомогою стандартних наборів реактивів.

Генетичне обстеження включало визначення поліморфізму алельних варіантів генів цитокінів ІЛ-10 та ІЛ-1b. Для генотипування використовували зразки ДНК, виділені з цільної венозної крові. Генотипування варіантів генів, які несуть на собі точкові заміни нуклеотидів ІЛ-1b (-511) та ІЛ-10 (-1082) в промоторних ділянках, визначали методом ПЦР-ПДРФ (полімеразна ланцюгова реакція та поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів).

Як контрольну групу обстежено 20 практично здорових дітей віком 7–15 років (середній вік 12,0 ± 3,5 року).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням стандартних програм для персонального комп’ютера за допомогою програмного пакета Statistica 6.0.

Результати дослідження та їх обговорення

Усі обстежені діти з хронічним гломерулонефритом були розподілені залежно від форми захворювання, під спостереженням знаходилися 16 (80,0 ± 8,9 %) дітей із гематуричною та 4 (20,0 ± 8,9 %) дитини з нефротичною формою. Серед обстежених хлопчики й дівчатка зустрічалися з однаковою частотою (по 50 %), а середній вік дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, становив 12,10 ± 0,81 року.

Аналіз особливостей сечового синдрому показав, що еритроцитурія та протеїнурія зустрічалися при всіх формах хронічного гломерулонефриту, але їх середні показники залежали від форми захворювання. Мінімальна еритроцитурія спостерігалася в 6 (30 %) обстежених дітей, помірна — у 12 (60 %), виражена — у 2 (10 %) дітей із гематуричною формою хронічного гломерулонефриту. Рівень білка в загальному аналізі сечі коливався від 0 до 2,95 г/л. Середній рівень концентрації білка при нефротичній формі перевищував у 4 рази вміст його при гематуричній формі (р < 0,005). Протеїнурія в більшості обстежених (90 %) була мінімальною (< 1 г/добу). Лише у 2 (10 %) дітей мала місце помірна протеїнурія (> 1 г/добу). У більшості обстежених дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, рівень сечовини й креатиніну крові відповідав віковій нормі й у середньому становив 6,02 ± 0,57 ммоль/л та 0,050 ± 0,002 мкмоль/л відповідно. Рівень загального холестерину сироватки крові в середньому становив 5,70 ± 0,38 ммоль/л, а загального білка — 71,4 ± 1,4 г/л.

Вивчення кліренсу за ендогенним креатиніном показало, що середній рівень клубочкової фільтрації не відрізнявся від вікових нормативів і становив 115,40 ± 3,98 мл/хв, але був вірогідно нижчим, ніж у здорових дітей (р < 0,005).

При визначенні поліморфізму алельних варіантів генів цитокінів ІЛ-1b (-511) у промоторних ділянках у дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, виявлено переважання генотипу С/Т (16 дітей, 80 %) поліморфної ділянки гену ІЛ-1b (-511), тоді як генотип С/С був визначений лише в 4 (20 %) обстежених (табл. 1).

Нами був проаналізований алельний поліморфізм ІЛ-10 (-1082) як одного з протизапальних цитокінів, що знижує запальну реакцію, однак патологічне зниження його продукції може призводити до посилення запальної відповіді. Згідно з отриманими результатами, у досліджуваній популяції для поліморфізму SNP -1082 гену ІЛ-10 в 50 % дітей виявлений генотип GA, у 40 % дітей зустрічався генотипи GG, а генотип АА мав місце лише у 2 (10 %) обстежених дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит.

При визначенні рівня ІЛ-1b в сироватці крові дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, залежно від наявності алельних варіантів гену ІЛ-1b встановлено, що в пацієнтів із генотипом СТ поліморфної ділянки гену ІЛ-1b відмічалася у 2,3 раза вища продукція ІЛ-1b в сироватці крові порівняно з дітьми з генотипом СС (табл. 2). При проведенні кореляційного аналізу виявлений прямий сильний зв’язок між рівнем ІЛ-1b в сироватці крові та генотипом СТ поліморфної ділянки гену ІЛ-1b (-511) (rxy = +0,56, р < 0,05), що може свідчити про підвищений рівень секреції даного цитокіну при наявності СТ генотипу ІЛ-1b.

При дослідженні взаємозв’язку між алельним поліморфізмом генів цитокінів та перебігом захворювання встановлено, що в більшості хворих на хронічний гломерулонефрит із торпідним перебігом був виявлений СТ генотип поліморфної ділянки гену ІЛ-1b, тоді як генотип СС зустрічався переважно в дітей із частковою клініко-лабораторною ремісією. Отримані дані дозволяють зробити припущення про важливість визначення поліморфізму генів цитокінів із метою можливого прогнозування перебігу захворювання у дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит.

При визначенні рівня креатиніну крові та ШКФ залежно від алельного поліморфізму генів інтерлейкінів (див. табл. 3) встановлено, що при наявності поліморфного варіанту гену IЛ-10 G/G у дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, спостерігалася вірогідно нижча ШКФ (в 1,2 раза, р < 0,05). Рівень креатиніну крові при різних варіантах поліморфізму гену IЛ-10 не мав вірогідної різниці порівняно з групою здорових дітей. При дослідженні показників у разі поліморфізму гену IЛ-1b встановлено, що ШКФ була зниженою як при генотипі С/Т, так і при С/С генотипі (в 1,2 раза) порівняно зі здоровими дітьми.

При дослідженні стану гемопоезу у хворих дітей на І стадії ХЗН залежно від алельного поліморфізму генів IЛ-1b та IЛ-10 встановлено, що вірогідне зниження рівня гемоглобіну спостерігається при наявності генотипу С/С IЛ-1b та генотипу А/А IЛ-10 (див. табл. 4). При наявності генотипу А/А IЛ-10 спостерігалося не лише зниження гемоглобіну, а й рівня еритропоетину втричі порівняно зі здоровими дітьми. При цьому вірогідне зменшення вмісту еритропоетину в сироватці крові хворих було виявлено й у випадку генотипу С/Т IЛ-1b без ознак анемії (в 1,5 раза). Також слід зазначити, що рівень еритропоетину вірогідно відрізнявся в дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, із С/С та С/Т генотипами IЛ-1b (в 1,6 раза, р < 0,05).

При дослідженні рівня сироваткового заліза в обстежених дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, залежно від поліморфізму генів IЛ-1b та IЛ-10 виявлено вірогідне його зниження при генотипі С/Т IЛ-1b (в 1,5 раза) та при генотипах А/А та G/A гену IЛ-10 (в 1,6 та 1,4 раза відповідно, р < 0,05).

Слід зазначити, що в дітей із поліморфною ділянкою гену С/Т IЛ-1b спостерігалися порушення гемопоезу, пов’язані з вірогідним зниженням рівня еритропоетину та сироваткового заліза в сироватці крові хворих, однак без ознак явної анемії, що може свідчити про значне зниження інкреторної функції нирок

Висновки

1. При визначенні алельного поліморфізму генів цитокіну ІЛ-1b ув дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, установлено, що генотип СТ поліморфної ділянки гену ІЛ-1b (-511) зустрічався у 80 % пацієнтів, у той час як у дітей із генотипом СС зустрічалося лише 20 %. При поліморфізмі SNP -1082 гену ІЛ-10 виявлено переважання генотипу GA (50 %), генотипи GG та АА спостерігались у 40 та 10 % хворих відповідно. У дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, із підвищеною продукцією ІЛ-1b в сироватці крові та з торпідним перебігом захворювання вірогідно частіше зустрічався генотип СТ гену ІЛ-1b (-511) (р < 0,05).

2. При виявленні генотипу G/G ІЛ-10 та С/Т, С/С генотипів ІЛ-1b (-511) у дітей, хворих на хронічний гломерулонефрит, відзначалася в 1,2 раза нижча ШКФ (р < 0,05).

3. У дітей із генотипом С/Т IЛ-1b має місце вірогідне зменшення вмісту сироваткового еритропоетину навіть за відсутності ознак анемії та дефіциту заліза, що може свідчити про значне зниження інкреторної функції нирок уже на І стадії ХЗН.

Таким чином, генетичні дослідження поліморфізму алельних варіантів генів цитокінів є перспективними у вивченні і встановленні нових маркерів прогресування ХЗН та можуть бути використані для прогнозуванні перебігу гломерулонефриту в дітей.