Журнал «Здоровье ребенка» 4 (39) 2012

Хвороби органів травлення в структурі загальної захворюваності дітей займають одне з провідних місць, тенденція до зростання питомої ваги цих захворювань продовжує зберігатися в останні десятиріччя [2]. Найбільш поширеною патологією в дитячому віці є хронічний гастрит (ХГ), що характеризується клітинною інфільтрацією слизової оболонки шлунка (СОШ) та підслизового шару з порушенням фізіологічної регенерації, що при тривалому перебігу викликає поступову атрофію залоз та прогресивне порушення секреторної, моторної та інкреторної функцій шлунка [1]. Нині, за даними багатьох досліджень, доведена етіологічна роль Helicobacter pylori (Нр) у розвитку ХГ [3, 5, 9]. Маркером високої вірулентності штаму Нр, що обумовлює більш агресивний перебіг захворювання, є наявність у «острівці патогенності» (PAI — pathogenicity island) геному цитотоксин­асоційованого гену А (СagA — cytotoxin associated gene A) [7, 10].

Відповідно до ключової концепції підтримання місцевого імунного гомеостазу СОШ головну роль у регуляції специфічної імунної відповіді відіграють антигенпрезентуючі клітини (дендритні клітини, В­лімфоцити, макрофаги), що здійснюють активацію Т­клітинної ланки імунітету [3]. Вивченню багаторівневих механізмів локального антихелікобактерного мукозального захисту в останні роки приділяється чимало уваги, тому що саме особливості розпізнавання, презентації антигенів збудника та антигенспецифічного диференціювання лімфоцитів обумовлюють тривалу персистенцію Нр у СОШ та різноманітність клінічних наслідків інфікування [5, 6, 8, 9].

Метою нашої роботи було дослідити роль імуномакрофагальної ланки локального гомеостазу слизової оболонки шлунка в умовах розвитку хронічних Нр­асоційованих гастритів у дітей залежно від CagA­статусу шляхом оцінки експресії маркерів Т­лімфоцитів CD3, В­лімфоцитів CD20, макрофагів CD68 та дендритних клітин S100.

Матеріали та методи дослідження

Під спостереженням перебувала 41 дитина (21 хлопчик та 20 дівчаток) віком від 8 до 17 років з діагнозом «хронічний гастрит», які лікувалися на базі КЗ «Міська дитяча клінічна лікарня № 1» м. Дніпропетровська протягом 2009–2010 рр. Усім пацієнтам у період виражених клінічних проявів була проведена фіброезофагогастродуоденоскопія (Pentax FG15W, Японія) з біопсією слизової оболонки антрального відділу шлунка та гістологічною оцінкою біоптатів згідно з вимогами морфологічного розділу сучасної Сіднейсько­Хьюстонської системи, доповнень Міжнародної класифікації гастриту та візуально­аналогової шкали з еталонами напівкількісної оцінки морфологічних змін.

За наявністю H.pylori всі досліджувані пацієнти були розподілені на 2 групи: Нр­позитивні та Нр­негативні. У свою чергу Нр­позитивні випадки за виявленням цитотоксин­асоційованого гену А (CagA) Нр були поділені на CagA­позитивні та CagA­негативні. Таким чином, сукупність Нр­негативних спостережень становила контрольну групу. Дані розподілу пацієнтів наведені в табл. 1.

Біоптати СОШ фіксувалися у 4% розчині нейтрального формаліну протягом доби і заливалися в парафін. Гістологічні зрізи завтовшки 4–6 мкм наносили на адгезивні предметні скельця SuperFrost Plus, після депарафінізації та регідратації зрізів проводили температурне демаскування антигенів — heat іnductіon of epіtope retrіeval (зрізи були розміщені в цитратному буфері з рН 6,0 і підігрівалися в автоклаві при температурі +121 °С упродовж 8 хвилин) та пригнічували активність ендогенної пероксидази 3% розчином перекису водню протягом 20 хвилин. Далі проводили інкубацію зрізів з первинними антитілами у вологих камерах при температурі 23–25 °С протягом 30 хвилин. Як первинні використовувалися моноклональні антитіла до CD3, CD20, CD68, S100 (LabVision) та поліклональні до НР (LabVision, Helicobacter pylori Rabbit Polyclonal Antibody). Титр антитіл добирався індивідуально для кожного маркера з використанням спеціального розчину Antibody Dіluent (DakoCytomation). Візуалізацію проводили за системою UltraVision Quanto (LabVision), ідентифікацію реакцій — за допомогою хромогену DAB (LabVision) під контролем мікроскопа від 20 секунд до 3 хвилин. Для диференціювання структур тканин зрізи додатково забарвлювали гематоксиліном Майєра і вивчали світловою мікроскопією з використанням мікроскопа Leika DLM­E (США) з об’єктивами ´10, ´20, ´40, ´100.

Згідно з Updated Sydney System, ступінь запалення слизової оболонки шлунка (мононуклеарна клітинна інфільтрація), поліморфноядерна клітинна інфільтрація, атрофія залоз та кишкова метаплазія були класифіковані за візуально­аналоговою шкалою як 0 — normal (нормальна), 1 — mild (слабка), 2 — moderate (помірна) та 3 — marked (значна) [1, 11]. Розрахунок CD3⁺ Т­лімфоцитів, CD20⁺ В­лімфоцитів, CD68⁺­макрофагів та S100⁺ дендритних клітин проводили в 10 полях зору і розраховували як середнє арифметичне абсолютних значень, при цьому відмічали загальну кількість імуноцитів, їх локалізацію (окремо — відсоток інтраепітеліального розташування з розрахунком на 1000 ядер) та аналізували ступінь забарвлення. Про стан слизової оболонки щодо атрофії судили за відносною товщиною епітеліальної пластинки, кількістю, величиною та глибиною шлункових залоз [4].

Щільність заселення Нр в антральному відділі шлунка оцінювалася за напівкількісною шкалою як негативна (0), слабка (1), помірна (2) та висока (3) [1, 4].

Визначення Нр­інфекції здійснювалося також за уреазним швидким тестом (Хелпіл­тест, ООО «АМА», Санкт­Петербург, Росія) як контроль. За Нр­негативне спостереження вважалось у випадку відсутності позитивних результатів імуногістохімічного дослідження і уреазного тесту. Оцінку CagA­статусу Нр­позитивних гастритів проводили за допомогою визначення сумарних антитіл до CagA­антигену у сироватці крові.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми SPSS Statistica 17.0. Для встановлення статистично значущих зв’язків між клініко­морфологічними ознаками та експресією маркерів використовувався непараметричний U­критерій Манна — Уїтні. Значущим вважався зв’язок при р < 0,05.

Результати та їх обговорення

Проведене морфологічне дослідження біоптатів слизової шлунка з ХГ свідчить про різке підвищення щільності лімфоцитарно­плазмоцитарного інфільтрату, що має дифузний характер із ураженням і епітеліального шару, і власної пластинки слизової.

Імуногістохімічне (ІГХ) дослідження з маркером CD3 (специфічний маркер Т­клітинної лінії) демонструє поширеність у стромі NK­клітин, що частіше дають цитоплазматичну реакцію з CD3 (рис. 1А) і міжепітеліальне розташування саме Т­лімфоцитів, що надають мембранну експресію маркеру CD3 (рис. 1Б). Вважається, що підсилення інфільтрації міжепітеліальними CD3⁺ Т­лімфоцитами при ХГ свідчить про їх участь у процесах клітинної регенерації на тлі Нр­колонізації та ушкодження епітеліоцитів. Але нами не було знайдено статистично вірогідної відмінності в спостереженнях між Нр­позитивними та Нр­негативними пацієнтами, р_u = 0,139 (табл. 2). Таким чином, підвищення рівнів інтраепітеліальних CD3⁺ Т­лімфоцитів та NK­клітин власної пластинки при ХГ свідчить про Нр­незалежні механізми місцевого захисту.

Результати ІГХ дослідження показали, що у випадках Нр­позитивних ХГ, коли колонізація Нр сягала помірного та високого рівнів, CD20⁺ В­клітинні інфільтрати були подані осередковими скупченнями, що утворювали фолікули зі світлими центрами розмноження (рис. 1Г), порівняно з поодинокими стромально або інтраепітеліально розташованими В­лімфоцитами Нр­негативних ХГ (рис. 1В). За непараметричним U­критерієм Манна — Уїтні спростовано нульову гіпотезу про однаковість виборок Нр­позитивних та Нр­негативних ХГ, р_u = 0,001 (табл. 2). Цікавим є те, що підгрупа CagA­позитивних пацієнтів також за цим показником має вірогідну відмінність порівняно з CagA­негативними ХГ (р_u = 0,04) і Нр­негативними ХГ (р_u < 0,000), що підкреслює особливість значення В­лімфоцитарної ланки як гуморального локального імунітету при Нр­асоційованих ХГ.

Згідно з даними табл. 3, знайдено статистично значущу відмінність між Нр­позитивними ХГ та Нр­негативними ХГ в абсолютної кількості CD68⁺ макрофагів (р_u = 0,006), особливо в підгрупі CagA­позитивних Нр⁺ ХГ (р_u = 0,002), як показано на рис. 2А, Б.

За допомогою моноклонального антитіла S100, що маркує клітини мієломоноцитарного походження, з різнорідного клітинного інфільтрату нам вдалося вилучити дендритні клітини, що відрізнялися довгими розгалуженими врізнобіч направленими відростками (рис. 2В). Локалізація навколо базальних шарів епітелію та направлення відростків до поверхні епітелію (рис. 2Г) ілюструє активну участь дендритних клітин у презентації антигенів та формуванні локального імунного гомеостазу СОШ. Але згідно з U­критерієм Манна — Уїтні вірогідної відмінності в розподілі дендритних клітин залежно від інфікування Нр, а відповідно і CagA­статусу при ХГ ми не знайшли, р_u > 0,05 (табл. 3).

Згідно з модифікованою сіднейською системою, в біоптатах слизової оболонки антрального відділу шлунка ми оцінювали ступінь контамінації Нр залежно від CagA­статусу, але вірогідної статистичної відмінності між CagA­позитивними та CagA­негативними ХГ знайдено не було, р_u = 0,296, що сівдчить про незалежність підвищеної цитотоксичної активності Нр від ступеня колонізації і навпаки (табл. 4).

Активність ХГ завжди проявляється в інфільтрації поліморфноядерними нейтрофілами епітелію та власної пластинки на тлі характерної лімфоцитарно­плазмоцитарної інфільтрації. Згідно з нашими даними, Нр­позитивні ХГ частіше перебігають як активні порівняно з Нр­негативними, особливо CagA­позитивні, що знайшло відображення в показниках статистичної значущості, р_u = 0,006 і р_u = 0,003 відповідно (табл. 4). При помірному та високому ступені активності запалення (13 (44,8 %) із 29 випадків) Нр­позитивних ХГ виявлялося проникнення нейтрофілів у покривно­ямковий епітелій з утворенням «внутрішньоямкових абсцесів». Як правило, такі зони характеризувалися глибокими деструктивними змінами епітеліоцитів та значним відсотком колонізації Нр, що підтверджувалося ІГХ­дослідженням із однойменним моноклональним антитілом.

Зв’язок Нр­інфекції зі ступенем ураження слизової антрального відділу шлунка також простежується за допомогою ще двох важливих морфологічних характеристик: атрофія залоз та кишкова метаплазія. Згідно з нашими даними, Нр­позитивні ХГ набагато частіше перебігають з атрофією залоз порівняно з Нр­негативними ХГ. 8 (27,6 %) із 29 досліджуваних пацієнтів мали 2–3­й ступінь атрофії, незважаючи на дитячий вік (табл. 5). Підгрупи CagA­позитивних та CagA­негативних пацієнтів також продемонстрували вірогідні відмінності порівняно з контрольною групою (р_u = 0,018; р_u = 0,013), що підтверджує безумовний зв’язок Нр­інфекції з розвитком атрофії СОШ. Аналогічна тенденція спостерігалася щодо кишкової метаплазії (р_u = 0,009): беручи до уваги зв’язок останньої з процесами злоякісного перетворення, ми отримали непрямі докази участі Нр­інфекції в розвитку неоплазій шлунка, особливо CagA­позитивних штамів (р_u = 0,002). Ці результати знаходять підтвердження в роботах багатьох дослідників [5, 9].

Таким чином, при дослідженні показників локального імунітету СОШ у дітей при ХГ із урахуванням наявності Нр (Нр­статус) та CagA (CagA­статус) було виявлено статистично значущі відмінності CagA⁺Нр­позитивних та Нр­негативних пацієнтів стосовно підвищення кількості CD20⁺­В­лімфоцитів (р_u = 0,001), CD68⁺­макрофагів (р_u = 0,006), поліморфноядерних лейкоцитів (р_u = 0,006), а також щодо виявлення атрофії (р_u = 0,007) та кишкової метаплазії (р_u = 0,009) СОШ. Аналогічна тенденція у повному обсязі спостерігалась при порівнянні Нр­позитивних пацієнтів із Нр­негативними.

CagA­негативні пацієнти мали статистично вірогідні відмінності від CagA­позитивних пацієнтів у рівні CD20⁺­В­лімфоцитів (р_u = 0,04) та відрізнялися від Нр­негативних пацієнтів за показником наявності атрофії СОШ (р_u = 0,013).

Висновки

1. Стан локального мукозального захисту СОШ при хронічних Нр­асоційованих гастритах у дітей характеризується розвитком імунозапальних реакцій як на неспецифічному, так і на специфічному рівні.

2. Характерною особливістю змін локального імунітету СОШ у CagA⁺Нр­позитивних пацієнтів є підвищення рівнів CD20⁺­В­лімфоцитів, CD68⁺­макрофагів, поліморфноядерних лейкоцитів.

3. Функціонування В­клітинної ланки локального імунітету СОШ у CagA⁺Нр­позитивних пацієнтів на тлі підвищення активності характеризується агрегацією В­лімфоцитів з утворенням лімфоїдних фолікулів.

4. Персистенція Нр у СОШ призводить до розвитку атрофії та кишкової метаплазії частіше у випадку інфікування CagA­позитивними штамами.