Журнал «Здоровье ребенка» 4 (39) 2012

Хелікобактерна інфекція є однією з найпоширеніших бактеріальних інфекцій людини, майже 50 % населення земної кулі є інфікованими Helicobacter pylori (HP) [1, 4]. Загальновизнаною є провідна роль НР у розвитку гастриту та виразкової хвороби [4, 5], а Міжнародною агенцією з вивчення раку Всесвітньої організації охорони здоров’я цей збудник визначений як канцероген I порядку на підставі даних його зв’язку з розвитком аденокарциноми та MALT­лімфоми шлунка [3].

Колонізація НР слизової оболонки шлунку (СОШ) людини може відбуватися вже в ранньому дитячому віці і, найімовірніше, пов’язана із внутрішньородинною передачею збудника [12, 13, 15, 17, 19].

Інфікування штамами, що містять у геномі цитотоксин­асоційований ген А (СagA — cytotoxin­associated gene A), за даними багатьох досліджень, характеризується більш агресивним перебігом захворювання, що є наслідком реалізації цитопатичних ефектів транслокації імунодомінантного протеїну СagA HP в епітеліоцити СОШ — перебудови цито­скелету, порушення щільних міжклітинних сполучень, змін проліферативного потенціалу й полярності епітеліоцитів шлунка, активації транскрипційних факторів та індукції синтезу прозапальних цитокінів [2, 6, 9, 10, 13, 14, 18, 21].

Ключовими компонентами системи вродженого захисту СОШ, що активуються негайно після контакту з патоген­асоційованими молекулярними структурами HP і забезпечують безпосередню антибактеріальну дію, є бета­дефензини — представники сімейства амфіфільних, катіонних пептидів із молекулярною вагою 3–4 kDa, що містять багато цистеїнових залишків, стабілізованих трьома дисульфідними зв’язками в певну просторову структуру — антипаралельний бета­складчастий лист [1, 20]. Дані багатьох досліджень свідчать, що бета­дефензини є також важливими елементами клітинно­опосередкованого адаптивного імунітету, тобто мають здатність залучати до вогнища запалення імунні клітини, регулювати процеси відновлення [8, 16].

Дослідження на тваринних моделях та у клінічних експериментах підтвердили значення НР­індукованої експресії бета­дефензину­2 (hBD2) у патогенезі запальних уражень шлунка та продемонстрували безпосередню участь hBD2 в ефективному кілінгу НР [6, 7, 10, 22].

Метою нашого дослідження було визначення ролі бета­дефензину­2 у механізмах локального антихелікобактерного захисту шляхом оцінки концентрації hBD2 у шлунковому вмісті залежно від CagA­статусу.

Матеріали та методи дослідження

Під спостереженням перебувало 79 пацієнтів віком від 9 до 17 років, хворих на хронічний гастрит, які лікувалися в гастроентерологічному відділенні КЗ «Міська дитяча клінічна лікарня № 1 ДОР» протягом 2009–2010 рр. Усім пацієнтам була проведена фіброезофагогастродуоденоскопія (Pentax FG15W, Японія) зі швидким уреазним тестом (Хелпіл­тест, ООО «АМА», Росія, Санкт­Петербург). За наявності H.pylori всі досліджувані пацієнти були розділені на 2 групи: Нр­позитивні та Нр­негативні. У свою чергу, Нр­позитивні пацієнти за виявленням у сироватці сумарних антитіл до цитотоксин­асоційованого гену А (CagA) Нр були поділені на CagA­позитивні та CagA­негативні. Таким чином, сукупність Нр­негативних спостережень склала контрольну групу. Дані розподілу пацієнтів наведені в табл. 1.

Визначення hBD2 у шлунковому вмісті проводили за методикою вестерн­блоту. Для виділення hBD2 зі зразків шлункового соку використовували метод зворотнофазової хроматографії із застосуванням як рухливої фази ацетонітрилу (CH₃CN), підкисленого 0,05% трифтороцтовою кислотою до pH 2,5. Отримані фракції збирали, ліофільно висушували та розчиняли в мінімальному об’ємі деіонізованої води (50 мкл) з наступним проведенням електрофорезу отриманих зразків у поліакриламідному гелі з підготуванням проб за Лемлі. Після електрофоретичного розділення та відмивання проводили електроперенос білків на нітроцелюлозну мембрану протягом 18 год при напруженості поля 60 В. Для блокування сайтів неспецифічного зв’язування антитіл нітроцелюлозну мембрану інкубували з розчином 1% ембріональної сироватки протягом 1 години, після чого відмивали PBS­T­буфером та інкубували з моноклональними антитілами (Інститут онкології АМН, Україна), специфічними до бета­дефензину­2 людини протягом 2,5 години [11]. Для візуалізації за допомогою реакції фотолюмінесценції в системі ICL додавали антитіла (кон’югат), мічені пероксидазою хрону, та інкубували протягом 1 години. Для проявлення нітроцелюлози використовували концентрат ECL. Проявляли блот, використовуючи рентгенівську плівку та стандартні реактиви для проявлення рентгенівських плівок (ОНИКО, Україна) (рис. 1).

Статистична обробка отриманих даних проводилася в програмі SPSS Statistica 17.0. Для встановлення статистично значущих зв’язків у випадку нормального розподілу даних використовувався параметричний t­критерій Стьюдента, у випадку відхилення від нормального розподілу — непараметричний U­критерій Манна — Уїтні. Значущим вважався зв’язок при р_u,t < 0,05.

Результати та їх обговорення

Середній вік пацієнтів основної групи становив 13,47 ± 2,56 року, контрольної — 14,32 ± 2,09 року. Вірогідну відмінність за показником середнього віку мали лише CagA­негативні пацієнти (12,74 ± 2,51 року, p_t = 0,032) (табл. 2).

Аналіз вікової структури продемонстрував зростання кількості випадків НР­асоційованої патології шлунка з віком за рахунок збільшення частки CagA­позитивних пацієнтів (рис. 2).

У клінічній картині хворих на хронічний НР­асоційований гастрит ступінь вираженості больового й диспептичного синдромів був вищим у групі CagA­позитивних пацієнтів (табл. 3).

Продукція hBD2 епітеліоцитами шлунка спостерігалась як серед НР­позитивних, так і серед Нр­негативних пацієнтів, але частота зустрічальності ознаки була вірогідно вищою в основній групі (p_u < 0,05), що збігається з даними інших авторів та свідчить про індуцибельність продукції hBD2 та зв’язок її з НР­статусом [1, 9, 22]. Частота зустрічальності виявлення hBD2 серед пацієнтів основної та контрольної груп наведена на рис. 3.

Аналізуючи середні рівні концентрації hBD2 у шлунковому вмісті досліджуваних пацієнтів, слід звернути увагу на значущі відмінності цього показника між основною та контрольною групами (р_u = 0,018). Крім того, пацієнти, інфіковані CagA­позитивними штамами НР, характеризуються вірогідно вищими рівнями hBD2 порівняно з НР­негативними пацієнтами (р_u = 0,017), тобто штами Нр, що містять CagA­ген, є більш потужними індукторами синтезу hBD2, що підтверджується даними інших дослідників [10, 21]. Дані, що характеризують рівні hBD2, наведені в табл. 4.

Аналізуючи вікові особливості продукції hBD2, слід відзначити зниження концентрації hBD2 у шлунковому вмісті пацієнтів 12–14 років незалежно від наявності CagA­гену, що може свідчити про певні вікові особливості реагування імунної системи у цьому віці (рис. 4).

Гендерні особливості досліджуваних груп характеризувалися вищими рівнями hBD2 у хлопчиків, інфікованих CagA­позитивними штамами Нр, але відмінності не мали вірогідної значущості (p_u = 0,194) (рис. 5).

Проведений аналіз зв’язку концентрації hBD2 з титрами специфічних сумарних антиСagA­антитіл у сироватці СagA­позитивних пацієнтів продемонстрував наявність прямо пропорційної залежності між цими показниками, що зображена на рис. 6.

Таким чином, при дослідженні концентрації hBD2 у шлунковому вмісті дітей з НР­асоційованою патологією шлунка та ДПК з урахуванням наявності Нр ­(Нр­статуса) та CagA (CagA­статуса) було виявлено статистично значущі відмінності CagA⁺Нр­позитивних та Нр­негативних пацієнтів стосовно частоти виявлення hBD2 (p_u < 0,05 ), а також порівняно зі значеннями середніх рівнів концентрації hBD2 основної та контрольної груп (р_u = 0,018), аналогічна тенденція спостерігалась при порівнянні CagA­позитивних пацієнтів із контрольною групою (р_u = 0,017). Вірогідність зниження концентрації hBD2 у шлунковому вмісті пацієнтів 12–14 років порівняно з пацієнтами інших вікових груп також була підтверджена статистично. Була виявлена залежність між рівнями hBD2 у шлунковому вмісті та титром сумарних антиСagA­антитіл у сироватці.

Висновки

1. Стан локального мукозального захисту СОШ при хронічних Нр­асоційованих гастритах у дітей характеризується розвитком імунозапальних реакцій як на неспецифічному, так і на специфічному рівнях.

2. Характерною особливістю змін локального імунітету СОШ є продукція антимікробних протеїнів hBD2, що є максимально вираженою у CagA⁺Нр­позитивних пацієнтів.

3. Наявність зв’язку між рівнями hBD2 та антиСagA­антитіл у сироватці є підтвердженням ролі hBD2 у механізмах взаємодії неспецифічної та адаптивної ланок імунітету.

Подяка

Автор висловлює щиру вдячність д.м.н, професору П.В. Погрібному (Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Е. Кавецького Національної академії наук України) за кваліфіковану допомогу у проведенні вестерн­блот­аналізу.