Журнал «Здоровье ребенка» 7 (42) 2012

Вступ

Ідентифікація специфічних генів й екзогенних факторів, які, взаємодіючи, формують стійкість людини до середовища проживання, становить значний інтерес для клінічної медицини. Однак, очевидно, спектр реакцій різних індивідуумів на однотипні впливи зовнішнього середовища достатньо варіабельний і коливається від збереження упродовж певного періоду здоров’я в одних до розвитку тяжких захворювань в інших. Якщо однакові впливи призводять до різних реакцій організму, то обов’язково постає питання про причинні фактори такої вибірковості.

Відомо, що діти є групою населення, найбільш сприйнятливою до шкідливих впливів зовнішніх факторів, унаслідок недосконалого розвитку всіх функціональних систем організму. Тому в умовах несприятливої екологічної ситуації особливої актуальності набирають проблеми вивчення внеску генетичних і факторів зовнішнього середовища в патогенез хронічних захворювань систем, що безпосередньо контактують із факторами зовнішнього середовща (дихальна система, шлунково-кишковий тракт і т.д.).

Бронхіальна астма (БА) займає провідне місце у структурі бронхолегеневих захворювань, що викликаються впливом пневмотропних забруднювачів. Доведено, що у 2–15 % пацієнтів основною причиною бронхіальної обструкції є безпосередній вплив органічних і неорганічних хімічних сполук [2, 6, 14, 16, 18]. У той же час дослідження останніх років показали, що клінічні прояви й перебіг БА в дітей, які проживають в однакових умовах, визначаються не стільки характером, складом і тривалістю впливу несприятливих факторів зовнішнього середовища, скільки індивідуальними особливостями організму. Тому актуальним є вивчення тих систем організму, які визначають тип та ступінь його реакцій у відповідь на впливи середовища.

Важливу роль у захисті легень від токсичних продуктів відіграють ферменти системи біотрансформації ксенобіотиків (ДТК). Біотрансформація полягає у модифікації фізичних властивостей ксенобіотиків від ліпофільних до гідрофільних, що полегшує їх виведення з організму. Дисбаланс між здатністю організму знешкоджувати ксенобіотики і їх надходженням в організм може призвести до небажаних наслідків, таких як порушення гомеостазу та накопичення токсичних речовин. Система захисту від ксенобіотиків представлена трьохетапним процесом, що включає фази активації, нейтралізації й виведення ксенобіотиків з організму та забезпечується системою ферментів ДТК [1, 5, 6, 11, 15, 18, 20]. Важливою особливістю цих ферментів є вибіркова локалізація і висока активність на головних шляхах надходження ксенобіотиків в організм — харчовому (печінка, ШКТ) і дихальному (легені, бронхи). У кожній групі ферментів, що беруть участь у детоксикації, можуть виявлятись мутантні ізоформи, функція яких порушена порівняно з нормальними алелями. На сьогодні відомо, що функціонально неповноцінні алелі значно частіше зустрічаються в осіб із захворюваннями, в етіології яких важливу роль відіграють несприятливі екзогенні фактори [3, 4, 6, 10, 13, 15, 18–20].

Процес ДТК регулюється відповідними генами, що контролюють кожну з фаз детоксикації. До таких генів належать: гени цитохромів Р450, цитоплазматичної та мікросомальної EPHX1, родини GST — GSTNT1, GSTM1, GSTP1, гени ацетилювання ксенобіотиків — NAT1, NAT2, VDR та ін. Гени, що контролюють синтез ферментів ДТК, належать до типових представників генів схильності (predisposing genes). Гени схильності — це, по суті, мутантні алелі, сумісні з народженням і життям у постнатальному періоді, але при певних умовах можуть сприяти розвитку того чи іншого захворювання. Залежно від природи провокуючого фактора їх зараховують до генів зовнішнього середовища (environmental genes) або до генів-тригерів, що запускають патологічний процес при поєднанні будь-яких несприятливих факторів [1, 4, 5, 9, 14, 16, 17, 21].

На відміну від моногенних хвороб, для виникнення яких достатньо наявності мутацій у структурному гені, БА належить до групи мультифакторних захворювань, у розвитку яких задіяні як генетичні, так і екзогенні фактори. Гени ферментів біотрансформації розглядаються як кандидати для формування БА у зв’язку з тим, що вони беруть участь у метаболізмі медіаторів алергічного запалення лейкотрієнів і простагландинів, а також у регуляції механізмів оксидативного стресу, що суттєво в патогенезі БА [3, 11, 13, 15]. Одним із генів, що можуть бути причетним до розвитку БА, є ген EPHX1, локалізований на хромосомі 1 у локусі 1q42.1. Фермент гена EPHX1 складається з 445 амінокислотних залишків. Ген EPHX1 може знаходитись у двох функціонально різних станах — повільному і швидкому, які обумовлені однонуклеотидними замінами у 3-му екзоні (мутація Т337С) (Tyr113His), генотип S/S й у 4-му екзоні (мутація А415G) (His139Arg), генотип F/F (Zusterzeel et al., 2001).

Метою нашої роботи була оцінка розподілу варіантних алелей гена ферментів І фази біотрансформації ксенобіотиків mEPHX1 у дітей, хворих на БА, залежно від тяжкості перебігу недуги та встановлення характеру його поліморфізму в популяції здорових та дітей із БА.

Матеріали і методи дослідження

Обстежені 94 дитини віком від 6 до 18 років, хворих на БА, які лікувалися в алергологічному відділенні ОДКЛ м. Івано-Франківська у 2009–2010 рр. Діагноз БА верифікували згідно з Протоколом діагностики і лікування БА у дітей. Щодо рівня контрольованості БА, то за результатами застосування тесту контролю астми (GINA, 2009) діти були розподілені так: 44 (46,8 %) — із частково контрольованою БА (ЧКБА), 50 (53,2 %) — із неконтрольованою БА (НБКА). Групу контролю становили діти, відібрані методом випадкової вибірки, що проживають у різних районах Івано-Франківської області (157 осіб). Матеріалом генетичних досліджень служила ДНК, виділена з лейкоцитів периферичної крові пацієнтів. Виділення та очистку ДНК проводили за допомогою комерційних наборів DIAtom™ DNA Prep200, GenePak DNA PCR test (ООО «Лаборатория ИзоГен», м. Москва, РФ), згідно з рекомендаціями виробника.

На подальших етапах дослідження проводили ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro, використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводили в автоматичному режимі на термоциклері «Терцик» («ДНК-технология», Росія), використовували олігонуклеотидні праймери (Fermentas, Вільнюс»Лаборатория ИзоГен», м. Москва, РФ). Специфічність ПЛР-продуктів визначали послідовністю специфічних праймерів, температурою відпалу та складом реакційної суміші. Для генотипування поліморфних локусів досліджуваних генів використовували різні програми проведення полімеразної ланцюгової реакції та кількість циклів.

Поліморфні варіанти гена EPHX1 визначали за допомогою мультилокусної ПЛР [6]. Математичну обробку результатів проводили з використанням статистичної програми Statistica. Вірогідність різниць у розподілі частот алелей, генотипів і фенотипів між групами визначали за критерієм c². У випадку попарного порівняння вибірок за частотою однієї ознаки використовували точний критерій Фішера.

Результати та їх обговорення

Під час дослідження нами проаналізовано поліморфізм генів першої фази ДТК у загальній вибірці пацієнтів із різною тяжкістю перебігу БА і контрольній групі. Проведений нами комплексний аналіз поліморфізму гену EPHX1 виявив ряд закономірностей (табл. 1).

Аналіз частоти комбінацій генотипів mEPHX1 генів детоксикації ксенобіотиків у дітей із різним ступенем контрольованості БА показав, що фенотиповий варіант БА значною мірою визначається станом генотипу. Зокрема, гомозиготна мутантна делеція СС (His113His) мала місце у 20,5 % обстежених із НКБА та у 12,0 % пацієнтів із ЧКБА (p < 0,05). При цьому вказаний показник у пацієнтів із НКБА відрізнявся від такого у здорових (p_N > 0,05). Порівняння частот аллелей і генотипів ТС (Tyr113His) у дітей із різним ступенем конт­ролю БА виявило, що в дітей із НКБА гетероносії становили 31,8 проти 46,0 % у дітей із ЧКБА (p < 0,05), причому вірогідно спостерігалась різниця з аналогічним показником у здорових (p_N < 0,01). Щодо порівняння частот нормального гомозиготного алеля ТТ (Tyr113Tyr) у дітей із різними фенотипами БА та у здорових, то вірогідної різниці виявлено не було.

Щодо наявності поліморфних варіантів локусу А415G гена mEPHX1 у дітей із різним ступенем контролю недуги, то отримані такі дані: у дітей із НКБА — гомозиготний варіант GG фіксувався вірогідно частіше (13,6 проти 8,0 % у здорових (p_N < 0,05)). Відомо, що переважання гомозиготного варіанта GG вказує на збільшення активності ферментів, що кодуються mEPHX1, до 20,0 % [1, 6, 26]. За таких умов можна припустити, що в дітей із тяжчим перебігом БА, незважаючи на високу активність ферментів, тяжкість перебігу недуги може визначатися недостатньою активністю продуктів генів ІІ фази ДТК. У той же час зростання активності ферментів, що кодуються mEPHX1, індукує накопичення активних інтермедіатів, сприяє виникненню оксидативного стресу і, як наслідок, розвитку захворювання. Гомозиготний варіант АА (His139 His) у дітей із ЧКБА та НКБА був на рівні 48,0 і 47,6 % відповідно та зустрічався значно рідше, ніж у здорових (p_N < 0,05). Гетерозиготний варіант АG (His139Arg) практично з однаковою частотою був зафіксований у дітей із НКБА (42,0 %) та ЧКБА (38,8 %). У той же час у здорових цей варіант зустрічався вірогідно частіше, ніж у дітей із БА (p_N < 0,05).

Із літературних даних відомо, що в носіїв мутантного генотипу СС швидкість ДТК знижується до 50,0 %, оскільки поліморфізм гена mEPHX1 чітко корелює з рівнем ферментативної активності білка (Zusterzeel et al., 2001). Проаналізувавши фенотипові прояви БА та спираючись на те, що фермент може знаходитись у декількох функціонально різних станах — повільному, швидкому, нормальному, обумовлених мутаціями в 3-му і 4-му екзонах відповідно, виділили 3 фенотипи — швидкий (має 1 або 2 мутації в 4-му екзоні і не має мутацій у 3-му екзоні (ТТ-GG або АG)); повільний (2 мутації в 3-му екзоні і відсутні в 4-му екзоні (СС-АА)); нормальний або проміжний (немає мутації в гені mEPHX1 або є гетерозиготним по мутаціях у 3-му і 4-му екзонах (ТТ-АА, або ­ТС-АG)) (табл. 2).

За отриманими нами даними, наявність повільного генотипу в дітей із НКБА в 1,5 раза перевищувала такий у дітей із ЧКБА. Висока активність ферменту спостерігалася в дітей із НКБА вірогідно частіше (p < 0,05). При цьому в дітей із БА незалежно від фенотипу найбільш поширеними були комбінації алелей АА-ТТ та АG-ТТ, що відповідають швидкому метаболізму ферментів ДТК в організмі, тобто спостерігалася тенденція до накопичення мутантного генотипу, що при недостатній активності ферментів ІІ фази ДТК призводить до накопичення активних інтермедіатів. Аналіз поширеності частот генотипів поліморфізму ТС-АG, що відповідає проміжному рівню ферментативної активності, виявив статистично вірогідну різницю частот у пацієнтів із ЧКБА (11,4 %) та НКБА (4,0 %) (p < 0,05). Найчастіше в пацієнтів із БА мав місце швидкий функціональний стан ферментів, що кодуються геном mEPHX1. Зокрема, поліморфізм АА-ТТ визначався у 18,0 % пацієнтів із НКБА та 15,9 % — із ЧКБА, а АG-ТТ — у 26,0 та 22,7 % відповідно. Доволі часто спостерігався і повільний функціональний стан гена mEPHX1, що відповідає варіантам гомо- та гетерозигот по мутантних алелях — СС-АА та ­ТС-АА. При аналізі поширеності частот даних генотипів між пацієнтами із НКБА та ЧКБА зареєстровані показники є більшими в дітей із тяжчим перебігом захворювання, хоча вірогідної різниці не виявлено. Поширеність алелей поліморфних варіантів гена mEPHX1, що віповідають проміжному рівню ферментативної активності, була меншою в обох групах пацієнтів, але при цьому вірогідно частіше зустрічалась у дітей із ЧКБА (p < 0,05).

Отже, тенденція до збільшення частоти мутантного генотипу в пацієнтів із БА та її пряма залежність від ступеня тяжкості захворювання вказує на те, що розвиток і прогресування БА в дітей можуть бути пов’язані з накопиченням проміжних електрофільних метаболітів, що сприяє виникненню оксидативного стресу. На основі отриманих результатів можна припустити, що комбінація різних поліморфних варіантів гена mEPHX1 та наявність швидких і повільних його варіантів є доволі вагомим прогностичним фактором щодо розвитку та тяжкості перебігу БА, а на реалізацію БА як екодетермінованої патології впливають індивідуальні варіанти метаболічної активності генів детоксикації ксенобіотиків.

Таким чином, генетичний поліморфізм генів ферментів біотрансформації ксенобіотиків призводить до відмінностей у їх активності, а притаманні ферментам індуцибельність і генетичний поліморфізм лежать в основі широкої міжіндивідуальної варіабельності в метаболізмі чужорідних сполук, створюючи можливість дисбалансу процесів детоксикації і токсифікації.

Висновки

1. На реалізацію БА як екодетермінованої патології впливають індивідуальні варіанти метаболічної активності генів детоксикації ксенобіотиків. Наявність генотипу СС та GG у дітей із БА із високою ймовірністю (p < 0,05) передбачає її неконтрольований перебіг.

2. У дітей із БА має місце висока ферментативна активність гена mEPHX1, що чітко корелює із ступенем тяжкості захворювання.

3. Генетичне тестування дітей із БА дозволяє виявити наявні у геномі тенденції до появи БА та розвитку захворювання певного ступеня тяжкості, намітити шляхи ранньої профілактики і за допомогою корекції послабити несприятливі ефекти функціонально неповноцінних алельних генів схильності.

Перспектива подальших досліджень. Розуміння механізмів спадкових і середовищних факторів у детермінації БА в дітей повинно в перспективі сприяти покращенню диференціальної діагностики і створенню принципово нових напрямків терапії захворювання. А кінцева оцінка практичної цінності генетичних маркерів БА вимагає продовження наукових досліджень у даному напрямку у великій популяційній вибірці.