Журнал «Здоровье ребенка» 2 (45) 2013

Хвороби органів дихання займають перше місце в структурі загальної захворюваності дітей та підлітків. Щороку спостерігається збільшення числа дітей, госпіталізованих у стаціонар із приводу гострого бронхіту, що ускладнює перебіг гострого респіраторного захворювання [7]. Висока частота захворюваності на бронхіт, у тому числі рецидивуючий, серед дітей обумовлена незрілістю структурних та функціональних систем респіраторного тракту (вузькість дихальних шляхів, м’якість та податливість хрящового каркасу, схильність слизової оболонки до набряку, повільна швидкість руху трахеобронхіального секрету, слабкість дихальних м’язів, слабкий кашльовий поштовх, низька збудливість дихального центру) на тлі недостатності або дисфункції місцевого або загального імунітету [9]. Крім того, тісний контакт слизової оболонки бронхів із такими агресивними факторами навколишнього середовища, як бактерії, віруси, інгаляційні алергени, дим, пил тощо, призводить до розвитку запальних уражень бронхів, які в разі тривалої дії патогенних агентів набувають стійкого характеру [2, 9]. Більшість дослідників вважають, що саме інфекційний фактор є тригерним, сприяє персистуванню запалення та викликає дисбаланс в імунній системі [10].

Запальні захворювання респіраторного тракту часто пов’язані з порушенням синтезу протимікробних пептидів, представником яких є дефензини [17]. Серед дефензинів виділяють дві основні групи: a­ та b­дефензини. a­дефензини (HNP 1–4) містяться в азурофільних гранулах нейтрофілів. Три основних дефензини людини (HNP 1–3) становлять приблизно 99 % усіх антимікробних пептидів даного типу [6, 20]. a­дефензини — це цистеїн­збагачені катіонні пептиди (невеликого розміру, 15–20 амінокислот) з антибактеріальними, антивірусними та імуномодулюючими властивостями [21]. Дія протимікробних пептидів призводить головним чином до порушення структури та функції цитоплазматичної мембрани мікроорганізмів, що змінює трансмембранну проникність, яка, в свою чергу, зумовлює прогредієнтну дисмінералізацію клітини та призводить до загибелі мікроорганізму [20, 22].

У процесі розвитку імунної системи дефензинам була відведена особлива імунорегулююча роль. З одного боку, дефензини мають протизапальні властивості за рахунок індукції секреції інтерлейкіну­10 (IL­10). З іншого боку, дефензини спрямовують до вогнища запалення нейтрофіли, В­клітини, макрофаги, призводячи до вивільнення медіаторів запалення, таких як IL­8, ­6, ­10, інтерферон­g та лейкотрієн B4 [18, 19, 23].

Таким чином, дефензини — це не тільки ендогенні антибіотики, вони також відіграють важливу роль в активації процесів запалення, репарації та регуляції адаптивної імунної відповіді [1, 22]. У процесі еволюції неспецифічного захисту макроорганізму від інфекційних патогенних агентів дефензини виявили себе як високоефективний, економічний, молекулярний механізм, що не потребує додаткової підготовки. Порушення експресії дефензинів супроводжується збільшенням ризику розвитку інфекційних, запальних, алергічних та автоімунних захворювань [1].

Мета дослідження — дослідити роль a­дефензинів 1–3 у формуванні антимікробного захисту в дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт, викликаний бактеріями роду Haemophilus.

Матеріали та методи

Для досягнення поставленої мети було проведено комплексне обстеження й лікування 32 дітей із рецидивуючим бронхітом у періоді загострення віком від 5 до 16 років (середній вік пацієнтів — 10,4 ± 1,3 року). Діагноз установлювався на підставі діагностичних критеріїв рецидивуючого бронхіту згідно з «Протоколом лікування дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт» (наказ МОЗ Україні № 18 від 13.01.2005 р.). Обов’язковий комплекс обстеження включав рентгенографію органів грудної клітки, дослідження загального аналізу крові, загального аналізу сечі, бактеріологічне дослідження харкотиння з визначенням чутливості до антибіотиків, огляд лор­лікаря. Вміст протимікробних пептидів — a­дефензинів 1–3 (Human Neutrophil Peptides 1–3, HNP 1–3) у плазмі крові досліджували методом імуноферментного аналізу з використанням комерційного набору HNP 1–3 (ELISA, Bio Tech Lab­S) Визначення вмісту IL­6 та ­10 у сироватці крові проводилося за допомогою комерційних наборів для імуноферментного аналізу Interleukin­6 та Interleukin­10 (DRG, США).

Результати та обговорення

На першому етапі роботи нами проведено бактеріологічне дослідження 68 дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт. За результатами цього дослідження встановлено, що домінуючою мікрофлорою — збудником означеного захворювання була гемофільна паличка, яка зустрічалася у 32 (47,1 %) пацієнтів. Серед виявлених штамів збудника H.influenzae зустрічалася у 20 (29,4 %) хворих, H.haemolyticus — у 4 (5,9 %), H.parainfluenzae — у 3 (4,4 %) та H.parahaemolyticus — у 5 (7,4 %) паціентів. Крім того, у 14 (20,6 %) дітей як етіологічний чинник виявлено S.pneumoniae, у 8 (11,8 %) — Klebsiella pneumonia, у 5 (7,4 %) — Enterococcus faecalis. Інші збудники зустрічалися значно рідше, тобто S.pyogenes було виявлено у 2 (2,9 %) дітей, Klebsiella pneumonia — у 3 (4,4 %) і Proteus mirabilis — у 1 (1,5 %) хворих. У 3 (4,4 %) пацієнтів встановлено наявність грибково­бактеріальної асоціації. Таким чином, для дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт, характерною була колонізація дихальних шляхів гемофільною паличкою, що підтверджувало дані літератури про суттєву роль означеного мікроорганізму в розвитку та підтримці запалення при інфекціях дихальних шляхів [4].

Виходячи з мети роботи, нами були відібрані для подальшого спостереження 32 дитини, хворі на рецидивуючий бронхіт, у яких при бактеріологічному дослідженні харкотиння виділено штами гемофільної палички. Додатково встановлено, що у 21 (65,6 %) дитини виділялися капсульні штами гемофільної палички, а в 11 (34,4 %) пацієнтів — безкапсульні (L­форми) гемофільної палички.

При дослідженні чутливості штамів гемофільної палички, виділеної з харкотиння дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт, до антибактеріальних препаратів встановлено, що домінуюча частина бактерій роду Haemophilus (92 %) була здатна до синтезу цефінази, що обумовлювало резистентність мікроорганізмів до амінопеніцилінів, карбоксипеніцилінів та уреїдопеніцилінів. У 24 % випадків виділені штами гемофільної палички виявляли стійкість до амоксициліну/клавуланату та у 74 % штамів відзначена резистентність до ампіциліну. При цьому у випадках наявності капсульованих штамів Haemophilus мікроорганізми, що були виділені, мали високу чутливість до цефалоспоринів ІІ–ІІІ покоління. L­форми гемофільної палички у 63,6 % випадків мали набуту резистентність до всіх типів b­лактамаз, однак виявляли чутливість до фторхінолонів та левоміцетину, і лише 36,4 % виявляли помірну чутливість до цефалоспоринів ІІ–ІІІ покоління на тлі високої чутливості до фторхінолонів та левоміцетину.

Наступним етапом роботи було дослідження вмісту a­дефензинів 1–3 у плазмі крові дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт. Відомо, що дефензини забезпечують антибактеріальний захист проти широкого спектра бактерій. Високий уміст протимікробних пептидів у циркулюючій крові зменшує число загострень бактеріальної інфекції та забезпечує більш легкий перебіг захворювання [22]. За результатами дослідження встановлено, що вміст означеного антимікробного пептиду в плазмі крові дітей контрольної групи становив 3583,3 ± 735,4 пг/мл, у той час як у групі дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт, рівень a­дефензинів 1–3 перевищував отримані результати майже вдвічі і становив 6576,7 ± 602,8 пг/мл, р < 0,01. Вважається, що a­дефензини виявляють виражену бактерицидну активність щодо Н.influenzae [12]. Одночасно в дослідженнях Kristy L.B. Mount і співавт. (2007), S.D. Rinker і співавт. (2011) було показано низьку антимікробну дію дефензинів, спрямовану на Haemophilus ducreyi [15, 17].

Як зазначено раніше, характеристики штамів бактерій роду Haemophilus, що були збудником рецидивуючого бронхіту, принципово різнилися, тобто встановлено наявність як капсульних, так і L­форм. Відомо, що первинною реакцією неспецифічних механізмів захисту у відповідь на інфікування L­формою Haemophilus influenzae є порушення кількох типів рецепторів епітеліоцитів слизової оболонки респіраторного тракту, нейтрофілів і макрофагів (рис. 1).

Однак основний внесок у розвиток запального процесу припадає на прозапальні механізми, що асоційовані з Toll­подібними рецепторами (TLR) — TLR­2 і TLR­4. Збудження TLR­2 — TLR­4 призводить до активації одного з основних прозапальних факторів транскрипції NF­kB. Білки зовнішньої мембрани Haemophilus influenzae, такі як OMР­2 і OMР­6, є потужними тригерами TLR­2. Показано, що OMP­6 активує продукцію IL­8, TNF­a макрофагами, а також індукує міграцію дендритних клітин. Основним лігандом TLR­4 є ліпополісахариди — патогенасоційовані молекулярні структури клітинної стінки грамнегативних бактерій. Відмінною ознакою ліпосахариду L­форм Haemophilus influenzae є дефіцит представництва O­антигену, у зв’язку з чим спостерігається неповна активація TLR­4 [15]. Недостатня активація TLR супроводжується і неповною активністю продукції дефензінів. Можливо, що висока частота розвитку біоплівок пов’язана саме з даною особливістю активації механізмів неспецифічного захисту [14].

Виходячи з вищенаведенного, на наступному етапі роботи ми проаналізували вміст у плазмі a­дефензинів 1–3 з урахуванням означеного факту. Проведений аналіз показав, що у дітей, в яких виділено L­форми гемофільної палички в плазмі крові, було відзначено лише сліди HNP 1–3, у зв’язку з чим ми припустили, що медикаментозна активація, зокрема лікопідом, TLR у хворих, запалення респіраторного тракту яких пов’язане з інфікуванням L­формами Haemophilus influenzae, може стати одним із можливих шляхів подолання рецидивування захворювання.

Одночасно у хворих, у  яких при бактеріологічному дослідженні харкотиння виділено капсульні штами гемофільної палички, концентрація a­дефензинів у плазмі крові в 1,9 раза перевищувала значення контрольної групи і становила 6766,7 ± 584,2 пг/мл.
Отримані результати виглядають логічно, якщо прийняти до уваги дані О.Є. Абатурова (2011), який вказує, що механізм антибактеріальної дії HNP 1–3 реалізується при взаємодії протеїну з поверхневими структурами бактерії та проникненні углиб негативно зарядженого фосфоліпідного шару бактерії, що призводить до порушення її цілісності та формуванню пори [1]. Унаслідок множинних дисемінованих порушень цілісності мембрани бактерії гинуть. Таким чином, наявність капсули бактерії певною мірою є тригером вивільнення HNP 1–3 з азурофільних гранул нейтрофілів.

При дослідженні цитокінового профілю сироватки крові було встановлено, що у дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт, порівняно з контрольною групою вміст прозапального IL­6 — цитокину, який регулює запальний процес та забезпечує мобілізацію запальної, а також антиген­специфічної імунної відповіді, мав лише тенденцію до підвищення (10,1 ± 2,0 пг/мл проти 9,1 ± 1,1 пг/мл у контрольній групі, р > 0,05). На цьому тлі ми спостерігали зростання більше ніж утричі рівня протизапального IL­10, що є продуктом Т­хелперів 2­го типу, відповідальних за формування гуморальної антиген­специфічної імунної відповіді — 4,42 ± 1,0 пг/мл проти 1,41 ± 0,59 пг/мл відповідно (р < 0,05). Як відомо, надлишок IL­10 веде до зниження протиінфекційного захисту та може сприяти хронізації запального процесу в дихальних шляхах [3]. Таким чином, встановлено порушення рівноваги між про­ та протизапальними цитокінами у дітей із рецидивуючим бронхітом, обумовленим бактеріями роду Haemophilus. Додатково проведений індивідуальний аналіз показав, що найбільш низькі значення IL­6 та високі IL­10 зафіксовано при наявності L­форм Haemophilus, що вочевидь у поєднанні з аномально низьким рівнем a­дефензинів 1–3 стало одним із факторів формування антибіотикорезистентності.

Отримані нами дані є обґрунтуванням для включення в схему лікування дітей із рецидивуючими бронхітами цефалоспорину ІІ покоління [5].

У результаті проведеної терапії цефалоспорином ІІ покоління вже з перших днів лікування спостерігалася позитивна динаміка клінічної картини. На 2–3­й день прийому препарату відбувалося поліпшення загального стану: зменшувалися симптоми інтоксикації, поліпшувалися сон, настрій, апетит. На 3­й день прийому антибіотика в усіх хворих нормалізувалася температура тіла. На тлі нормалізації загального стану з 3–4­го дня аускультативна картина в легенях характеризувалася зменшенням кількості хрипів і повним їх зникненням на 5–7­й день терапії. Одночасно відбувалося зменшення інтенсивності та полегшення кашлю, поліпшення реологічних характеристик харкотиння. На 5–7­й день антибактеріальної терапії спостерігалася позитивна динаміка гематологічних показників із повною нормалізацією гемограми на 8–10­й день лікування.

Клінічно повне одужання на 7­й день від початку лікування цефалоспорином ІІ покоління досягнуто у 26 (81,2 %). У 6 (18,8 %) дітей одужання було неповним унаслідок нечастого сухого кашлю, що зберігався. Проведений індивідуальний аналіз показав, що в усіх дітей, в яких не відбувалося повного одужання до 7­го дня лікування, при бактеріологічному дослідженні харкотиння виділялися L­форми Haemophilus, що потребувало подовження курсу антибактеріальної терапії до 10–14­го дня та додаткового призначення імуномодулюючої терапії. Препаратом вибору став глюкозамінілмурамілдипептид (ГМДП) з огляду на результати дослідження Е.А. Цывкина і співавт. (2010), які вказували, що застосування означеного імунотропного препарату при бактеріальних інфекціях приводило до підвищення рівня a­дефензинів у лейкоцитах периферичної крові [11]. Крім того, згідно з анотацією, препарат стимулює бактерицидну та цитотоксичну активність фагоцитів, посилює проліферацію Т­ і В­лімфоцитів, підвищує синтез специфічних антитіл. Фармакологічна дія препарату відбувається за допомогою посилення вироблення інтерлейкінів, зокрема IL­1, ­6, ­12, фактора некрозу пухлини a, інтерферону­g, колонієстимулюючих факторів. Також ГМДП підвищує ефективність антибактеріальних препаратів, зокрема цефалоспоринів. Препарат застосовувався сублінгвально натще за 30 хвилин до приймання їжі в дозі 1 мг 1 раз на добу протягом 10 днів.

При проведенні контрольного мікробіологічного дослідження після курсу антибактеріальної терапії в усіх хворих патогенна флора у значущих концентраціях не визначалася.

Слід визнати, що на сучасному етапі можливості медикаментозного керування продукцією дефензинів вивчено недостатньо. Так, О.Є. Абатуров і співавт. (2011) [1] вказують, що основними лікарськими засобами, які активують синтез дефензинів, також є пробіотичні препарати, вітамін D, лейкотрієни В4. Однак це питання потребує подальшого вивчення.

Висновки

1. Провідним етіологічним фактором у розвитку загострення рецидивуючого бронхіту в дітей є гемофільна паличка, що підтверджується високим ступенем колонізації дихальних шляхів (47,1 %).

2. Наявність капсульних форм Haemophilus супроводжується підвищенням рівня a­дефензинів 1–3 у плазмі крові, в той час як вивільнення L­форм гемофільної палички не супроводжується підвищенням синтезу антимікробних пептидів.

3. У дітей, хворих на рецидивуючий бронхіт, відбувається порушення рівноваги між про­ та протизапальними цитокінами, що виявляється збільшенням умісту IL­10 у сироватці крові на тлі недостатнього синтезу IL­6. Означені зміни найбільш виражені за наявності L­форм Haemophilus.

4. Застосування цефалоспорину ІІ покоління в комплексній терапії рецидивуючого бронхіту у дітей показало високу ефективність препарату щодо Haemophilus та безпечність.

5. З метою посилення антибактеріальної дії цефалоспорину ІІ покоління та індукції синтезу a­дефензинів у плазмі крові за наявності L­форм Haemophilus необхідно вирішити питання про додаткове призначення імунотропної терапії.