Журнал «Здоровье ребенка» 2 (45) 2013

Введение

Открытие Barry Marshall и Robin Warren в 1983 году Helicobacter pylori (H.pylori) и признание последней как этиологического инфекционного фактора развития воспаления слизистой оболочки желудка обусловило активное изучение особенностей патогенеза и течения H.pylori-ассоциированных заболеваний [1]. В предупреждении возникновения инфекционного процесса и элиминации патогенов, в том числе Н.pylori, ведущую роль играет система неспецифической защиты макроорганизма. Молекулярные механизмы, индуцирующие воспалительный процесс слизистой оболочки желудка в ответ на инфицирование H.pylori, до настоящего времени остаются недостаточно изученными. Реакция макроорганизма на внедрение H.pylori обусловлена сложным взаимодействием факторов вирулентности H.pylori, компонентов мукозальной защиты и иммунной системы макроорганизма, нутритивными, экологическими и другими факторами.

Защита макроорганизма от патогенных инфекционных агентов обусловлена функционированием двух взаимосвязанных иерархических иммунных систем — неспецифической врожденной и специфической адаптивной. Неспецифические механизмы врожденного иммунитета представляют филогенетически более древнюю систему защиты организма от агрессивного воздействия микроорганизмов в сравнении с адаптивной иммунной системой. В отличие от специфического ответа иммунной системы, для развития которого требуется определенное время, реакция неспецифических механизмов защиты практически мгновенная.

Ведущим принципом функционирования врожденных механизмов неспецифической противоинфекционной защиты является обнаружение образ-распознающими рецепторами (pattern-recognition receptors, PRR) молекулярных эволюционно консервативных структур — патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) инфекционных агентов. Наиболее известными PAMP являются структурные компоненты наружной мембраны: липополисахариды (lipopolysaccharide, LPS) грамотрицательных бактерий; тейхоевая и липотейхоевая кислоты преимущественно грамположительных бактерий; пептидогликаны грамположительных и грамот­рицательных бактерий; липоарабиноманноза микобактерий, а также зимозан грибов; цитозин-гуанин-последовательности бактериальных ДНК, одно- и двуспиральные вирусные РНК. Каждый инфекционный агент характеризуется уникальной комбинацией PAMP, которая взаимодействует с определенными PRR макроорганизма, что обусловливает возникновение особенностей воспалительного процесса, ассоциированных с этиологией заболевания [2–4]. Все идентифицированные до настоящего времени виды PRR характеризуются способностями распознавать PAMP независимо от стадии жизненного цикла патогенных инфекционных агентов и конститутивно экспрессироваться клетками макроорганизма, причем их экспрессия не связана с механизмами иммунной памяти [2, 5].

Разнообразие PRR представлено совокупностью солютабных и клеточно-ассоциированных (мембранных, цитоплазматических) рецепторов распознавания образов. Сигнальные трансмембранные Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors — TLR) занимают центральное место в многоуровневой системе распознавания PAMP. Основные клинические эффекты связаны с функционированием PRR, в частности TLR-рецепторов, и TLR-аксессуарных молекул, прежде всего липополисахарид-связывающего белка (LBP), CD14, MD2. TLR-рецепторы регулируют активацию врожденного иммунитета, а также обеспечивают взаимосвязь с приобретенным иммунитетом через антигенпрезентирующие клетки (дендритные клетки, макрофаги).

Наиболее представительными РАМР грамот­рицательных бактерий являются липополисахариды (LPS) — структурные компоненты наружной мембраны, в том числе Н.pylori — ведущий возбудитель хронической гастродуоденальной патологии у детей.

Раскрытие молекулярных механизмов неспецифической защиты врожденного иммунитета, в частности роли TLR-рецепторов и TLR-аксессуарных молекул, позволило уточнить значение последних в развитии хеликобактерной инфекции у детей. LPS Н.pylori являются мощными триггерами воспалительного процесса слизистой оболочки желудка, действие которых предопределяет течение заболевания. В рекогниции LPS H.pylori также принимают участие и аксессуарные молекулы — LBP, CD14, MD2 [2, 5–7]. Первоначально, попадая на слизистую оболочку желудка, в экстрацеллюлярном пространстве LPS связывается с солютабным LBP, который функционирует как опсонин для гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-связанного белка CD14. Протеин CD14 представлен двумя формами — мембраносвязанной (mCD14) и солютабной (sCD14). Взаимодействие комплекса LPS / LBP с достаточным количеством солютабной формы sCD14 предопределяет его связывание и передачу сывороточным липопротеинам высокой плотности, которые служат своеобразным «стоком» LPS, что обеспечивает элиминацию LPS из организма и таким образом снижает выраженность LPS-ассоциированных эффектов. Комплекс LPS/LBP транспортируется в печень и связывается с mCD14 на поверхности макрофагов. Организация ассоциированного с цитоплазматической мембраной клетки мультимера LPS/TLR4/MD2 приводит к активации TLR4, интрадомен которого, взаимодействуя с адаптерной молекулой MyD88, обусловливает возбуждение каскада сигнальных молекул, индуцирующих продукцию провоспалительных цитокинов, хемокинов, активированных кислородсодержащих метаболитов и активных радикалов азота, формируя Th₁ ответ [8, 9].

Именно адекватное возбуждение PRR обус­ловливает эффективную эрадикацию патогенного инфекционного агента, репарацию поврежденных тканей, выздоровление пациента, тогда как недостаточная активация PRR может стать причиной развития хронизации воспаления, а чрезмерная — возникновения аутоиммунного процесса [2]. В связи с этим понимание функционирования молекулярных механизмов неспецифического врожденного иммунитета, в частности TLR и TLR-аксессуарных молекул, — важнейшее условие для дальнейшего совершенствования методов лечения и профилактики заболеваний, в том числе хронической Н.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии.

Цель исследования: изучить роль механизмов распознавания LPS Н.pylori в развитии локального воспаления слизистой оболочки желудка у детей с хеликобактерной инфекцией.

Материалы и методы

Под наблюдением находилось 55 детей (30 мальчиков и 25 девочек) в возрасте от 10 до 16 лет, проходивших обследование и лечение в условиях гастроэнтерологического отделения коммунального учреждения «Днепропетровская городская детская клиническая больница № 1» Днепропетровского областного совета. Пациенты были выбраны методом случайных чисел и в зависимости от наличия Н.pylori были разделены на две группы.

В I (основную) группу вошли 28 (50,9 %) детей, больных хроническим Н.pylori-ассоциированным гастродуоденитом (ХГД HP «+»), во II (сравнения) — 27 (49,1 %) детей, больных хроническим гастродуоденитом, не ассоциированным с Н.pylori (ХГД HP «–»), в стадии обострения.

Для верификации диагноза наряду с выяснением жалоб и анамнеза заболевания, физикальным осмотром, общеклиническим лабораторным обследованием проведено эндоскопическое исследование пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК) по общепринятой методике со взятием двух биоптатов слизистой оболочки (СОЖ) антрального отдела желудка. Для идентификации Н.pylori-инфекции использовали: быстрый уреазный «Хелпил»-тест и дыхательный «Хелик»-тест (ООО «АМА», Россия, Санкт-Петербург), определение в сыворотке венозной крови суммарных иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) к Ag СаgА белка H.pylori методом ИФА («Вектор-Бест», Россия). Метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) применяли для оценки концентрации в сыворотке крови sCD14, используя ELISA test kit (Diaclone, France).

Уровень экспрессии гена TLR4 определяли методом полимеразной цепной реакции (PCR) в режиме реального времени (real-time) в НИИ генетических и иммунных основ развития патологии и фармакогенетики Высшего государственного учебного заведения Украины «Украинская медицинская стоматологическая академия» (Полтава). Выделение общей РНК из клеток СОЖ проводили с помощью пакета реагентов «РИБО-золь-В» (AmpliSens, Россия). Для получения кДНК в реакции обратной транскрипции использовали праймер олиго (dT) 18. Анализировали экспрессию гена TLR4 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в присутствии красителя SYBR Green I, путем относительного количественного анализа. В качестве референтного гена использовали ген b-актина. Для анализа данных применяли относительный Ср метод с расчетом по формуле DСр = Ср (TLR4) – Ср (b-актина).

Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью статистических программ Statgraf, Matstat. Достоверность различий оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента в случае нормального распределения данных и критерия Манна — Уитни в случае распределения, отличавшегося от нормального.

Результаты

Основная и группа сравнения обследованных пациентов по возрасту и полу достоверно не отличались друг от друга. Так, средний возраст детей, больных ХГД HP «+», был 13,48 ± 0,62 года, во II группе ХГД HP «–» — 12,78 ± 0,38 года. Мальчики в І группе детей составили 64,3 %, во II группе — 51,9 %; девочки — соответственно 35,7 и 48,1 %.

В клинической картине большинства наблюдаемых пациентов доминировали болевой, диспептический и астеновегетативный синдромы. Ведущим клиническим синдромом у детей обеих групп был болевой, однако его характер и выраженность отличались у детей с ХГД HP «+» по сравнению с пациентами ІІ группы .

Клинической особенностью у детей с ХГД HP «+» была более выраженная интенсивность болевого синдрома в отличие от группы с ХГД HP «–», который характеризовался наличием практически у 1/2 (13–46,4 %) пациентов боли язвенноподобного характера даже при отсутствии эрозивно-язвенного поражения слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки. У пациентов с ХГД HP «–» интенсивность болевого синдрома была менее выраженной, чаще преобладала боль ноющего характера, чувство распирания в эпигастральной области. У детей обеих групп отмечалось усиление болей после нарушения диеты, физических нагрузок, боль была чаще периодической, чем постоянной. Диспептические симптомы также были более выраженными у детей с ХГД HP «+» в сравнении с пациентами группы ХГД HP «–» и чаще проявлялись снижением аппетита (в 1,4 раза); тошнотой, отрыжкой кислым воздухом (в 1,3 раза); метеоризмом, неустойчивостью стула со склонностью к запорам (в 1,5 раза). Астенический синдром (общая слабость, недомогание, снижение аппетита, повышенная утомляемость, нарушение сна, лабильность эмоционального тонуса) регистрировался у детей в обеих группах практически с одинаковой частотой.

У пациентов с выраженным болевым и диспептическим синдромом в сыворотке крови регистрировались резко положительные (1 : 40–1 : 80) титры анти-CagA-антител (r = 0,35 и r = 0,40 соответственно). Эндоскопические особенности хеликобактер-ассоциированной гастродуоденальной патологии были также взаимосвязаны с уровнем анти-CagA-IgA, -M, -G. Чем выше был титр анти-CagA-IgA, -IgM, -IgG (1 : 40–1 : 80), тем более выраженным был воспалительный процесс в СОЖ и ДПК: гастрит эрозивный и диффузный гиперпластический (r = 0,35), бульбит эрозивный и диффузный гиперпластический (r = 0,36).

Результаты исследований экспрессии TLR4 в биоптате СОЖ и концентрации sCD14 (нг/мл) в сыворотке крови детей, больных ХГД, показали, что экспрессия TLR4 в биоптате СОЖ детей, больных ХГД HP «+», была увеличена по сравнению с показателями детей, больных ХГД HP «–» (1,59 ± 0,12 и 1,28 ± 0,09 соответственно, Pu < 0,05). Уровень концентрации sCD14 был достоверно увеличен в сыворотке крови детей, больных ХГД HP «–», по сравнению с показателями в группе детей, больных ХГД HP «+» (15033,3 ± 1531,3 и 4009,5 ± 401,8 соответственно, Pu < 0,05).

Обсуждение

Результаты полученных нами исследований показали, что у детей с хроническим гастродуоденитом, ассоциированным с H.pylori, выраженность интенсивности клинико-эндоскопических проявлений и длительность поражения была ассоциирована с уровнем специфического иммунного ответа на фактор вирулентности СаgA H.pylori. Высокие титры антительного ответа свидетельствовали о наличии выраженного воспалительного процесса в СОЖ в периоде обострения заболевания, однако реакция приобретенного специфического иммунитета не является ведущей в саногенезе хеликобактерной инфекции, о чем свидетельствует отсутствие взаимосвязи скорости эрадикации H.pylori и уровня титров анти-CagA-IgA, -IgM, -IgG классов.

В научной литературе приведены противоречивые данные по поводу роли LPS Н.pylori и TLR4 в развитии хеликобактер-ассоциированного воспаления в СОЖ. Fredrik Backhed и соавт. [12] не показали участия TLR4-ассоциированного нарушения в развитии воспаления при хеликобактерной инфекции, так как в период обос­трения болезни на эпителиоцитах СОЖ им не удалось идентифицировать TLR4. Однако Leisa Mandell и соавт. [13] показали, что индукция цитокинов LPS Н.pylori опосредована активацией TLR4. Макрофаги, у которых отсутствует TLR4, остаются интактными после стимуляции LPS Н.pylori.

Полученные нами данные исследований свидетельствуют о том, что развитие Н.pylori-ассоциированного гастродуоденита у детей сопровождается повышением экспрессии TLR4 в СОЖ как ключевого сенсора LPS Н.pylori в отличие от гастродуоденита, не ассоциированного с Н.pylori, при котором отмечается увеличение уровня концентрации TLR4-аксессуарной молекулы sCD14.

Подобные данные представлены Shigetada Teshima и соавт. [10], показавшими в своих работах непосредственное влияние LPS Н.pylori на активность воспалительного процесса в СОЖ. В дальнейшем и другие исследователи показали, что при хеликобактерной инфекции именно с действием LPS ассоциирована продукция провоспалительных цитокинов, хемокинов и др., которые являются медиаторами воспалительного процесса в СОЖ и обусловливают характер течения заболевания [2, 11].

Полученные нами данные свидетельствуют, что наличие сниженного уровня sCD14 в сыворотке крови больных ХГД детей способствует инвазии Н.pylori, хеликобактерная инфекция развивается при наличии именно сниженного уровня sCD14. Более высокие уровни концентрации sCD14 у детей, больных ХГД HP «–» (по сравнению с показателями в группе детей, больных ХГД HP «+»), могут свидетельствовать, что хеликобактерная инфекция развивается при наличии низкой концентрации sCD14. По всей вероятности, показанное в некоторых исследованиях отсутствие возбуждения TLR4 при инфицированности H.pylori в большей степени свидетельствует не об отсутствии провоспалительного потенциала LPS H.pylori с TLR4, а о противовоспалительном эффекте протеина sCD14, который при достаточной концентрации секвестрирует LPS H.pylori от взаимодействия с TLR4 СОЖ.

По нашему мнению, низкие уровни концентрации sCD14, вероятно, способствуют взаимодействию комплекса LPS/LBP с мембрано­связанной формой протеина mCD14, который транспортирует его к особому белку — мембран-ассоциированному протеину MD2, и возбуждает TLR4. Этот факт подтверждается и данными S. Kumar Pachathundikandi и соавт. [14]: при развитии хеликобактерной инфекции отмечается повышенная экспрессия TLR4 и MD2 эпителиальными клетками. Мультимерный комплекс LPS/TLR4/MD2 способствует активации каскада сигнальных молекул и факторов транскрипции, которые усиливают экспрессию генов, что в дальнейшем приводит к активации синтеза и секреции провоспалительных цитокинов с развитием воспалительной реакции в СОЖ.

Заключение

Таким образом, в основе развития инфекционно-воспалительного процесса, вызванного H.pylori, и его неблагоприятного течения лежит функциональный дефицит неспецифических механизмов защиты СОЖ. Развитие воспалительного процесса в СОЖ у детей с хронической гастродуоденальной патологией зависит от взаимодействия LPS Н.pylori как с его ключевым сенсором TLR4, так и с TLR-аксессуарным протеином sCD14. Достаточный уровень sCD14 снижает выраженность LPS-ассоциированных провоспалительных эффектов H.pylori. В условиях низкой концентрации sCD14 LPS Н.pylori взаимодействует с mCD14, приводя к образованию комплекса LPS/TLR4/MD2, который активирует воспалительный процесс в СОЖ. Учитывая протективную роль в реализации врожденного иммунного ответа TLR и TLR-аксессуарных молекул, участвующих в рекогниции LPS H.pylori, в частности sCD14, новым направлением в лечении хеликобактерной инфекции у детей может быть медикаментозная регуляция активности TLR4 и продукции sCD14.