Журнал "Гастроэнтерология" 1 (47) 2013

Введение

Протективная функция слизистого барьера толстого кишечника во многом определяется уровнем экспрессии эпителиальных муцинов и их свойствами. Целью данной работы была оценка влияния изменений экспрессии муцинов (MUC2, MUC3, MUC4) и трефоилового пептида (TFF3) на состояние слизистого барьера толстого кишечника у больных неспецифическим язвенным колитом (НЯК). Было обследовано 49 больных НЯК, выполнено эндоскопическое исследование с биопсией слизистой оболочки толстой кишки (СОТК) и морфологическим исследованием биоптата. У всех больных НЯК выявлено снижение числа бокаловидных клеток, при этом степень их уменьшения коррелировала с тяжестью НЯК, снижение уровня экспрессии секреторного (MUC2) и мембраносвязанных (MUC3, MUC4) муцинов. Отмечалась высокая экспрессия TFF3. Следовательно, для больных НЯК характерно снижение защитного слизистого барьера за счет уменьшения MUC2 и MUC3. Выявленные изменения коррелировали со степенью тяжести НЯК. Наблюдается нарушение взаимодействия муцинов и трефоилового фактора, что снижает протективные свойства муцинов и регенераторный потенциал слизистой оболочки толстого кишечника у больных НЯК. 

Актуальность

Защитная функция слизистого барьера толстого кишечника определяется балансом клеточного и гуморального иммунитета, оптимальным соотношением облигатной и факультативной флоры, количеством и свойствами толстокишечной слизи. Уровень экспрессии и степень гликозилирования муцинов характеризуют состоятельность протективной функции муцинов. Эпителиальные муцины — это большая группа секретируемых, а также трансмембранных гликопротеинов, богатых серином, треонином и пролином, связанных большим числом олигосахаридных цепей. На сегодняшний день идентифицировано более 20 муцинов, большинство генов локализуются на хромосоме 11.pq15,5 [1, 2]. Муцины подразделяются на 2 класса соединений: секреторные (MUC2, MUC5AC, MUC5В, MUC6) и трансмембранные муцины (MUC1, MUC4, MUC13, MUC16, MUC17) [1, 3]. Муцины активно экспрессируются эпителием желудочно-кишечного тракта и формируют высокомолекулярный вязко-эластический слой, являющийся протективным барьером между поверхностью слизистой оболочки и полостным содержимым желудочно-кишечного тракта, представляющий собой питательную среду для жизнедеятельности комменсальных бактерий кишечника [2, 3]. Изменения вязко-эластических свойств слизи формируются при взаимодействии муцинов с микроорганизмами, электролитами, белками и пищевыми компонентами. В условиях развития воспалительного процесса муцины претерпевают характерные преобразования: сульфатирование снижается, а сиалирование увеличивается, что отражает снижение резистентности муцина к бактериальному разрушению и способствует повышению проницаемости слизистого барьера кишечника [1, 2, 4].

Согласно современным представлениям, в тонком кишечнике, слепой кишке и проксимальных и дистальных отделах толстого кишечника преимущественно экспрессируются MUC2, MUC4, MUC3 и MUC17, при этом в неизмененной слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта их локализация совпадает с распределением трефоиловых пептидов. Трефоиловые факторы (TFF1–3) наряду с муцинами играют важную роль в формировании гастроинтестинального барьера и выполняют протективную и регенераторную функции [4, 5]. TFF синтезируются и секретируются муцинпродуцирующими клетками и тесно связаны с муцинами. Однако молекулярные механизмы взаимодействия муцинов и трефоиловых пептидов, а также многообразие их свойств еще недостаточно хорошо изучены [3, 4]. Считается, что в отличие от TFF1 и TFF2 только TFF3 экспрессируется колоноцитами [4, 5]. Все три трефоиловых фактора обеспечивают процессы миграции клеток, участвуют в полимеризации муцинов, способствуя повышению защитной функции эпителия [5, 6]. Изменения слизистого барьера кишечника при неспецифическом язвенном колите могут характеризоваться изменением экспрессии муцинов и трефоиловых пептидов и приводить к снижению защитных свойств мукозного слоя слизистой оболочки кишечника, что стимулирует клетки иммунной системы, способствует поддержанию воспаления в толстом кишечнике при НЯК. 

Целью данной работы была оценка влияния изменений экспрессии муцинов (MUC2, MUC3, MUC4) и трефоилового пептида (TFF3) на состояние слизистого барьера толстого кишечника у больных НЯК.

Материалы и методы

Было обследовано 49 больных левосторонним НЯК в стадии обострения, среди которых было 24 мужчины и 25 женщин. Средний возраст больных составлял (38,3 ± 9,2) года. Помимо общеклинических методов обследования всем больным НЯК было проведено эндоскопическое исследование с биопсией слизистой оболочки толстой кишки и морфологическим исследованием биоптата. Фиксация биоптата слизистой толстой кишки проводилась в 4% растворе нейтрального формалина на одни сутки с последующей заливкой в парафин. Гистохимическую идентификацию муцинов (MUC2, MUC3, MUC4) и TFF3 проводили в биоптатах, фиксированных в 10% нейтральном забуференном формалине (рН 7,2–7,4) в течение 18–24 часов, заливали в парафин по общепринятой методике [1, 6]. Для характеристики слизеобразования проводилась PAS-реакция, с помощью которой выявляли гликопротеиды, гликолипиды и гликоген. Другие срезы окрашивали альциановым синим при значениях рН 1,0 и 2,5. При рН 1,0 сульфатные группы углеводов приобретают достаточный заряд для связывания положительно заряженных молекул красителя. При рН 2,5 окрашивали как сульфатные, так и карбоксильные группы углеводов, которые входят в состав сиаловых, глюкуроновой и индуроновой кислот. С помощью этой методики определяли сульфатированные и несульфатированные протеогликаны и гликопротеины [4, 6].

Иммуногистохимическое исследование муцинов (MUC2, MUC3, MUC4) и трефоилового пептида (TFF3) выполняли на парафиновых срезах. Демаскировку антигенов проводили в цитратном буфере (рН = 6,0) при кипячении на водяной бане в течение 1 часа. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела (USBiological, США), а также систему визуализации KP-500 (Diagnostic Biosystems, США). При просмотре препаратов на светооптическом уровне антигенпозитивные клетки идентифицировали по их коричневому окрашиванию.

Все обследованные больные получали базисную терапию препаратами 5-аминосалициловой кислоты в течение 30 дней в сочетании с ферментными препаратами и пробиотиками. Эндоскопическое и морфологическое исследования проводились у больных НЯК до начала терапии и после ее окончания.

Результаты

Клиника НЯК была типичной и характеризовалась нарушениями стула, поносами от 4 до 10 раз в день с примесью крови и слизи, тенезмами, ночными дефекациями, вздутиями кишечника, болевым, астеноневротическим синдромами. Среди обследованных больных НЯК у 25 (62,5 %) пациентов было выявлено среднетяжелое течение, а у 15 (37,5 %) диагностировано легкое течение НЯК. При эндоскопическом исследовании у всех больных НЯК до терапии выявляли гиперемию СОТК с изменением сосудистого рисунка, отечность слизистой толстой кишки с «зернистостью» — грануляциями мембранной поверхности слизистой оболочки, рассеивающими отраженный свет. Эрозии или язвы, повышенная ранимость СОТК, примеси слизи, фибрина, гноя обнаружены практически у всех больных, и степень выраженности этих изменений коррелировала со степенью тяжести НЯК.

До терапии у всех больных НЯК выявлено снижение числа бокаловидных клеток, при этом степень их уменьшения коррелировала с тяжестью НЯК и варьировала от незначительного уменьшения количества бокаловидных клеток с преобладанием клеток с мелкими, незрелыми вакуолями у больных НЯК легкой степени до выраженного снижения и иногда полного отсутствия бокаловидных клеток у пациентов со среднетяжелым течением НЯК. Выявлены истончение, дистрофия поверхностного эпителия с перестройкой крипт, кроме того, у всех больных обнаруживались дефекты поверхностного эпителия — от микроэрозий до глубоких язв, заполненных некротическими массами. На этом фоне у всех больных НЯК выявлена усиленная воспалительная клеточная инфильтрация слизистой оболочки толстой кишки, интенсивность которой колебалась от умеренной до выраженной.

В воспалительном клеточном инфильтрате у больных НЯК чаще преобладали лимфоциты — 24 (80 %) больных, плазмоциты преобладали у 18 (60 %) пациентов, а макрофаги — у 14 (46,7 %) больных. Нейтрофилы обнаруживались в инфильтрате у 18 (60 %) больных НЯК, при этом активные сегментоядерные лейкоциты, содержащие гликоген, обнаружены у 13 (43,3 %) пациентов. Более чем у половины больных НЯК выявлялись внутриэпителиальные лимфоциты, что свидетельствует об активности воспалительного процесса.

Помимо изменений клеточного состава слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК выявлены нарушения слизеобразования. У всех больных выявлено уменьшение количества внутриклеточной и внеклеточной слизи с изменением ее свойств. При проведении PAS-реакции, окрашивании альциановым синим рН 2,5 и рН 1,0 интенсивность окрашивания у всех больных НЯК была ниже нормы (P < 0,01), что свидетельствует об изменениях состава толстокишечной слизи, уменьшении в ней гликозамингликанов и гликопротеинов.

Уровень экспрессии секреторного (MUC2) и мембраносвязанных (MUC3, MUC4) муцинов у всех пациентов с НЯК был низким, при этом наиболее выраженным было снижение MUC2 и MUC3, проявляющееся негомогенностью окрашивания вакуолей бокаловидных клеток вплоть до его полного отсутствия, что свидетельствует о значительном снижении секреторной активности СОТК, снижении ее протективной функции при НЯК. При этом отмечалось интенсивное окрашивание муцинов в цитоплазме вокруг вакуолей и умеренное — в базальных отделах клеток эпителия, что может отражать высокую интенсивность метаболических процессов в эпителиальных клетках кишечника. В то же время низкая экспрессия MUC2 и MUC3 в поверхностном эпителии, выявленная у большинства обследованных пациентов с НЯК, может характеризовать неэффективность репаративных процессов слизистой оболочки при обострении заболевания (рис. 1а).

У 29 (59,2 %) обследованных больных НЯК отмечалось окрашивание клеток стромы от слабой до высокой экспрессии как MUC2, так и MUC3, что свидетельствует об активности митоза и процессов дифференцировки эпителиальных клеток стромы в бокаловидные экзокриноциты. Эти изменения могут индуцироваться высокой интенсивностью воспалительного процесса в толстом кишечнике и носить компенсаторный характер (рис. 1б). Экспрессия секреторных муцинов индуцируется провоспалительными цитокинами: TNF-а, INF-у, IL-6. Поэтому ее отсутствие в вакуолях бокаловидных клеток и появление в строме свидетельствует также о локализации воспалительного процесса в собственной пластинке СОТК, характерной для НЯК. В то же время хроническое воспаление, вызванное бактериальными инфекциями (энтеропатогенная и гемолизирующая E.coli, Salmonella enteritidis, Clostridium difficile и др.), ассоциируется с повышенной экспрессией секреторных муцинов в поверхностных отделах, ограничивая проникновение микроорганизмов в глубь слизистой оболочки кишечника, что может являться дополнительным дифференциально-диагностическим критерием.

Уровень MUC4 был низким у большинства больных НЯК, однако снижался в меньшей степени по сравнению с MUC2 и MUC3 (рис. 1в). В то же время у трети обследованных больных экспрессия MUC4 была высокой.

Избыточная активация трансмембранных муцинов приводит к стимуляции ядерного фактора транскрипции (NF-kB) и канонического ингибитора ядерного фактора кВ киназы в (IKK-в), ассоциирующихся с неоплазией, индуцированной хроническим воспалением, что может объяснять высокую частоту малигнизации при длительном течении НЯК.

Экспрессия TFF3 в слизистой оболочке толстого кишечника у больных НЯК в целом по группе была высокой в отличие от секреторных муцинов, что свидетельствует о нарушении регуляторного влияния трефоиловых пептидов на экспрессию и протективные свойства муцинов.

При этом локализация TFF3 также характеризовалась неравномерностью: в большей степени экспрессия наблюдалась в базальных отделах клеток крипт, умеренная — в вакуолях бокаловидных клеток (рис. 1г). В некоторых случаях отмечалась выраженная поверхностная локализация TFF3 в сочетании с отсутствием или низкой экспрессией MUC2 и MUC3, что, вероятно, отражает истощение секреторной функции бокаловидных клеток при сохранении стимулирующего влияния TFF3 на муцинообразование в ответ на воспаление.

Следовательно, для больных НЯК характерно снижение защитного слизистого барьера как за счет уменьшения разреженного (MUC2 и MUC3), так и за счет плотного слоя муцинов, сформированного в большей степени мембрановстроенными муцинами (MUC3 и MUC4). Наблюдается нарушение взаимодействия муцинов и трефоилового фактора, что снижает протективные свойства муцинов и регенераторный потенциал слизистой оболочки толстого кишечника у больных НЯК. Это приводит к уменьшению толщины и вязкости мукозного слоя СОТК, снижению колонизационной резистентности вследствие отсутствия питательного субстрата для жизнедеятельности облигатной флоры. Уменьшение толщины слизистого слоя способствует снижению как гуморального (IgA), так и клеточного компонентов защитного барьера, локализованных в мукозном геле, повышению проницаемости кишечного барьера для различных токсинов, микроорганизмов, бактериальных полисахаридов, индуцирующих и поддерживающих иммунный воспалительный ответ в кишечнике.

Степень выраженности выявленных изменений экспрессии муцинов варьировала в зависимости от степени тяжести НЯК. Так, у пациентов со слабой активностью НЯК отмечались значительные нарушения экспрессии MUC2, который не определялся у 90 % больных. MUC3 был выявлен только у 20 % пациентов. В то же время умеренная экспрессия MUC4 отмечалась более чем у половины больных — 62 %, а высокая — у 38,5 % пациентов, что, вероятно, свидетельствует о компенсаторном увеличении синтеза мембраноассоциированного муцина (MUC4) на фоне снижения общей секреторной активности. Отмечалась высокая экспрессия TFF3 у 70 % больных с легкой степенью тяжести НЯК, в то же время у 15 % обследованных TFF3 не определялся.

Достоверных отличий экспрессии MUC2 и MUC3 между группами больных с легкой и средней степенью тяжести НЯК выявлено не было. У пациентов с умеренной степенью тяжести НЯК экспрессия секреторного MUC2 выявлялась только у 30 %, а мембраносвязанного MUC3 — у 35 % больных, при этом выраженность экспрессии муцинов была минимальной. В то же время более выраженные нарушения экспрессии MUC4 были выявлены у больных со средней степенью тяжести НЯК: отсутствие MUC4 наблюдалось у 28 % больных, низкая экспрессия — у 38 % и умеренная — у 34 % больных НЯК. В этой группе также преобладали пациенты с выраженной экспрессией TFF3.

У 100 % больных НЯК тяжелой степени отмечалось абсолютное отсутствие экспрессии MUC2 и MUC3 в бокаловидных клетках, экспрессия MUC4 отмечалась у 70 % больных, однако была низкой, что свидетельствует о наиболее выраженных изменениях синтеза и секреции муцинов у этой группы пациентов. Стимулирующее влияние провоспалительных цитокинов на экспрессию и секрецию муцинов, вероятно, нивелировалось длительным течением заболевания и истощением компенсаторных механизмов защиты слизистого слоя кишечника у обследованных больных НЯК. Уровень TFF3 был низким у 30 % обследованных, высокая экспрессия сохранялась у 70 % больных НЯК с высокой активностью воспалительного процесса в толстом кишечнике.

Таким образом, наиболее выраженные нарушения экспрессии муцинов наблюдались у больных НЯК тяжелой степени с выраженной активностью воспалительного процесса в толстом кишечнике. Значительное снижение секреторных и трансмембранных муцинов отмечалось при средней степени тяжести НЯК. Повышение экспрессии муцинов наблюдается в фазе ремиссии НЯК, что отражалось на уровне MUC4 в группе больных с минимальной активностью заболевания (легкая степень тяжести НЯК). Степень выраженности нарушений экспрессии муцинов коррелировала с активностью воспалительного процесса в толстом кишечнике у больных НЯК, отражала эффективность компенсаторных процессов в зависимости от стадии заболевания.