Журнал «Здоровье ребенка» 3 (46) 2013

Питання вивчення факторів ризику, особливостей клініки та ранньої діагностики інфекційно­запальних захворювань сечової системи в дітей для педіатрів мають особливе значення у зв’язку з їх високою поширеністю і не завжди сприятливим прогнозом. За останні роки відзначається зростання питомої ваги інфекцій сечової системи в загальній структурі захворюваності в дітей з 18 на 1000 до 36–100 на 1000 дитячого населення [1, 3, 7]. У переважної більшості дітей запалення призводить до необоротних пошкоджень паренхіми нирок iз заміщенням ушкоджених ділянок сполучною тканиною, що надалі призводить до розвитку хронічної ниркової недостатності й артеріальної гіпертензії [2, 5–7]. Хоча багато факторів, що призводять до розвитку пієлонефриту (ПН), загальновідомі (обструкція, дисметаболічні порушення, спадковість тощо), тим не менше, у 41 % дітей склерозування розвивається за відсутності порушень уродинаміки, тобто безпосередньою причиною ниркового пошкодження в дітей є інфекція, що супроводжується місцевою активацією й запуском цитотоксичного метаболізму [10, 17, 18]. Тому на сьогодні для вдосконалення медичної допомоги дітям з інвалідизуючими хронічними захворюваннями надзвичайно важливі дослідження, спрямовані на вивчення факторів ризику їх розвитку та прогресування.

Спектр мікроорганізмів, що викликають інфекції сечовивідних шляхів та нирок, різноманітний та залежить від віку, статі, шляхів поширення та форми перебігу захворювання. В останній час у генезі інфекцій сечових шляхів у дітей велика увага приділяється ролі внутрішньоклітинних збудників, а саме Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis [4, 5, 7, 14]. Встановлено, що саме ці збудники відіграють провідну роль у розвитку рецидивуючого перебігу інфекцій сечової системи та при цьому часто перебігають як мікст­інфекції з бактеріальною флорою [8, 9, 13].

У зв’язку зі змінами, що відбуваються за останнє десятиліття в етіологічній структурі збудників пієлонефриту в дітей, та розвитком стійкості мікробної флори до раніше широко застосовуваних хіміопрепаратів дуже актуальними є дослідження регіональних особливостей етіології збудників, оскільки успіх лікування й прогноз пієлонефриту багато в чому залежать від правильно підібраної й вчасно розпочатої антибактеріальної терапії, що практично завжди починається з емпіричного призначення антибактеріальних препаратів [12, 14, 17, 18].

Слід зауважити, що, окрім характеристики збудника, розвиток та перебіг ПН визначається індивідуальними властивостями макроорганізму­господаря (насамперед здатністю давати адекватну імунну відповідь), що є відображенням його генетичної структури. Тому одним із сучасних підходів у запобіганні розвитку будь­якої патології є генетичне прогнозування ризику її формування. Це стало можливим тільки в останні роки, коли стартували біомедичні дослідження, спрямовані на розробку методів детекції молекулярних особливостей формування мультифакторних захворювань. На сьогодні відкривається все більше факторів, що свідчать про генетичну схильність до розвитку багатьох ниркових захворювань [7, 8, 17–19].

Імунологічний захист від різних патогенів здійснюється в результаті скоординованої роботи вродженої (неспецифічної) і адаптивної (специфічної) систем імунітету, взаємодія яких забезпечує ефективний перебіг імунної відповіді [15, 18]. Розпізнавання чужорідних для організму молекулярних структур мікробного походження, відомих як патогенасоційовані молекулярні патерни (pathogen associated molecular patterns — PAMPs), здійснюється за допомогою так званих патернрозпізнаючих рецепторів (ПРР) [2].

У результаті структурних досліджень до групи ПРР були віднесені й Toll­подібні рецептори (TLR). У людини Toll­подібні рецептори являють собою сімейство молекул, що налічує 13 індивідуальних рецепторів (на даний час добре охарактеризовані 11 із них), які здатні розпізнавати практично всі основні типи патогенів, у тому числі й різні типи бактерій, віруси, гриби, найпростіших та паразитів [14].

На сьогодні роль Toll­подібних рецепторів у розвитку багатьох інфекцій залишається нез’ясованою й потребує детального вивчення. Дефекти в системі Toll­подібних рецепторів, такі як порушення розпізнавання лігандів, експресії TLR, трансдукції сигналу, синтез ефекторних молекул, а також поліморфізм генів Toll­подібних рецепторів можуть призводити до розвитку тяжких інфекційних, автоімунних захворювань, атеросклерозу, алергопатології тощо [14–16]. Нашу увагу привернув поліморфізм TLR4 Asp299Gly, адже існує ряд досліджень, які свідчать про те, що наявність саме цих мутантних алелей генів підвищує ризик зараження урогенітальними інфекціями, такими як хламідіоз, мікоплазмоз, уреоплазмоз, гарднельоз, трихомоніаз [8, 9]. Поліморфізм генів припускає, що з одного й того ж гена може бути скопійовано кілька структурно відмінних копій одного й того ж білка, при цьому частина скопійованих варіантів або не відзначається активністю, або може мати протилежну функцію. Оскільки відмінності в генах, що контролюють захисні реакції організму, можуть визначати різний характер перебігу запальної відповіді та специфічних імунологічних реакцій при впровадженні чужорідних агентів, вивчення поширеності однонуклеотидних замін у дітей із хронічним ПН становить особливий інтерес [15, 16].

Мета нашого дослідження: із сучасних позицій оцінити значимість поліморфізму Asp299Gly Toll­подібного рецептора 4 у реалізації схильності до хронічного пієлонефриту в дитячому віці та проаналізувати його асоціації з основними збудниками інфекцій сечової системи.

Об’єкт та методи дослідження

Проведено клініко­лабораторне обстеження 53 дітей, хворих на хронічний пієлонефрит, під час загострення, які перебували на стаціонарному лікуванні в педіатричному відділенні № 2 (нефрологічні ліжка) дитячої обласної клінічної лікарні м. Полтави.

Відбір біологічних зразків від хворих, за якими спостерігали, проводився за умови відсутності інфекційних захворювань. Матеріалом для дослідження була периферична венозна кров, забір якої проводився із кубітальної вени в стерильні вакутайнери із стабілізатором (ДТА) із наступним внесенням її в епендорфи з реактивом «Днк­експрес». Генотипування поліморфної ділянки Asp299Gly проводили методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням олігонуклеотидних праймерів. Ампліфікацію проводили на ампліфікаторі «Терцик» («ДНК­Технология», Москва).

Поліморфну ділянку Asp299Gly гена Toll­подібного рецептора 4 ампліфікували за допомогою ПЛР у 25 мкл реакційної суміші, до якої входило: 2,5 мкл 10 x Buf для ампліфікації; 2 мМ хлориду магнію; 0,2 мМ кожного dNTP; 2,5 од. ДНК­полімерази Tag; 20–50 нг геномної ДНК; по 66 нг праймерів для Asp299Gly.

Бактеріологічне дослідження сечі із встановленням мікробного збудника та його чутливості до антибактеріальних і хіміотерапевтичних засобів, а також молекулярно­біологічне дослідження (полімеразна ланцюгова реакція для визначення Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, матеріал дослідження — зіскрібок епітеліальних клітин з уретри) у більшості хворих здійснювали до призначення антибактеріальної терапії.

Групу контролю становили 95 практично здорових осіб із бази генетичних зразків НДІ генетичних та імунних основ розвитку патології та фармакогенетики ВДНЗУ «УМСА». Від усіх пацієнтів була отримана добровільна письмова згода на участь у науковому досліджені, що проводилось із дозволу комісії з біоетики Вищого державного навчального закладу України «Українська медична стоматологічна академія».

Математичну обробку отриманих даних проводили з використанням програми Statistica for Windows 7.0 (StatSoft Inc.) і електронних таблиць MS Excel. Розподіл генотипів по досліджуваних поліморфних локусах перевіряли на відповідність рівновазі Харді — Вайнберга за допомогою критерію c². Для порівняння частот алелей між групами, що досліджувались, використовували критерій c² Пірсона з поправкою Ієйтса на безперервність при числі ступенів свободи, що дорівнює 1. Порівняння частот генотипів між групами, що досліджуються, проводили шляхом аналізу таблиць спряженості за допомогою точного тесту Фішера. Для порівняння частот варіантів у незв’язаних групах вираховували відношення шансів із визначенням 95% довірчого інтервалу. Для усіх видів аналізу статистично значимими вважали відмінності при р < 0,05, при 0,05 < p £ 0,1 відмічали тенденцію до відмінності.

Отримані результати

Проведений аналіз розподілу частот генотипів за досліджуваним геном TLR4 Asp299Gly в групах спостереження наведений в табл. 1.

Як видно із табл. 1, «дикий» тип генотипу TLR4 зустрічався у 91,6 % здорових осіб, частота гетерозиготного генотипу становила 8,4 %, мутантного GG — 0,0 %. На той час як у дітей, хворих на хронічний пієлонефрит, частота генотипів AG і GG майже у 2 рази перевищувала показники групи контролю (AG — 13,2 % та GG — 1,9 %), що відповідало теоретично очікуваному відповідно до рівноваги Харді — Вайнберга. Тобто група хворих осіб наближається до вимог ідеальної популяції, еволюційні зміни якої відбуваються шляхом зміни генофонду загальної сукупності генів кожної такої популяції.

Вивчення поширеності нормальної й мутантної алелі 299Gly гена Toll­подібного рецептора 4 в обстежуваних групах (табл. 2) показало, що мутантний алель Gly практично у 2 рази частіше виявлявся в дітей із хронічним пієлонефритом (8,4 %) порівняно з групою контролю (4,21 %) (р < 0,05).

Генетичні маркери можуть визначати схильність до захворювання в цілому або бути асоційованими з конкретними етіопатогенетично значимими ознаками. Тому в рамках нашої роботи важливим етапом став аналіз асоціації поліморфізму гена TLR4 з основними збудниками інфекцій сечової системи у дітей із хронічним пієлонефритом. Для вирішення поставленого завдання ми сформували дві підгрупи дітей: перша — хворі із гетерозиготним та гомозиготним за мутантною алеллю генотипом (Asp/Gly, Gly/Gly), а в групу порівняння увійшли діти з хронічним пієлонефритом із нормальним розподілом алелей. Аналізуючи параметри захворювання, ми виявили вірогідні відмінності серед хворих із різними варіантами генотипів (табл. 3).

Результати молекулярно­біологічного обстеження хворих на хронічний пієлонефрит дітей свідчать, що частота виявлення мікоплазменної інфекції в дітей першої підгрупи більше ніж в 4 рази перевищувала показники групи порівняння (87,5 та 20 % відповідно). Ureaplasma urealyticum також у 3 рази частіше реєструвалася в дітей із мутантним алелем на противагу дітям із нормальним розподілом алелей (37,5 та 12,5 % відповідно). Внутрішньоклітинні збудники у переважної більшості дітей обох підгруп виявлялися у вигляді моноінфекції (62,5 та 92,5 % відповідно), а визначення асоціацій декількох збудників вірогідно частіше реєструвалося в дітей першої підгрупи на противагу дітям із нормальним розподілом алелей (37,5 та 7,5 % відповідно).

Результати бактеріального обстеження хворих на хронічний пієлонефрит дітей свідчать, що в переважної більшості дітей обох підгруп бактеріальну флору не визначали (75,0 та 67,5 % відповідно). Можливими причинами отримання негативних результатів бактеріологічного дослідження, на наш погляд, були: початок проведення антибактеріальної терапії в амбулаторних умовах, до направлення в стаціонар. Серед бактеріальних збудників у дітей першої підгрупи в рівній кількості були зафіксовані кишкова паличка та клебсієла на противагу хворим дітям із нормальним розподілом алелей, у яких домінували кишкова паличка та ентеробактерії, а клебсієла й протей були зареєстровані в одиничних випадках.

Висновки

Таким чином, отримані дані засвідчують, що гетерозиготний та гомозиготний за мутантною алеллю генотипи можуть розглядатися як пре­диктори підвищеного ризику реалізації хронічного пієлонефриту, що асоціюється з формуванням фенотипових проявів захворювання, з переважанням рецидивуючого і торпідного перебігу запальних змін та необхідністю проведення тривалої підтримуючої уросептичної терапії.

На підставі вивчення генотипічних особливостей хронічного пієлонефриту в дітей із поліморфізмом гена Toll­подібного рецептора 4 (TLR4) визначено, що гетерозиготний та гомозиготний за мутантною алеллю генотипи асоціюються із підвищеною чутливістю до основних внутрішньоклітинних збудників (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum) ПН, що дозволяє розглядати поліморфізм гена Toll­подібного рецептора 4 як додатковий прогностичний показник у генетичних дослідженнях.

Тому індивідуальний підхід до пацієнта, заснований на науковій інтерпретації результатів генетичного дослідження, їх зіставленні з даними клінічних, лабораторних та інструментальних методів дозволяє здійснити ранню діагностику генетично детермінованих захворювань і запропонувати максимально ефективну схему профілактичних і лікувальних заходів для попередження прогресування патологічного процесу.