Журнал "Гастроэнтерология" 3 (49) 2013

За останнє десятиліття спостерігається зростання захворюваності на гастроезофагеальну рефлюксну хворобу (ГЕРХ), що належить до найпоширеніших хвороб органів травлення у розвинених країнах і охоплює 30–40 % їх дорослої популяції [1, 7, 8]. У нашій країні поширеність ГЕРХ серед цивільного населення досягає 30 % [5], а серед військовослужбовців — 42,4 % [6]. Основними причинами виникнення патологічного гастроезофагеального рефлюксу (ГЕР) вважають первинне зниження тиску і транзиторне розслаблення нижнього стравохідного сфінктера (НСС) [12] внаслідок підвищеної продукції оксиду азоту (NO) [13, 14]. Розслаблення стравоходу і НСС здійснюється за рахунок неадренергічної нехолінергічної іннервації, у якій NO є головним медіатором, що вивільняється з неадренергічних нехолінергічних (NANC) нейронів міжм’язового сплетення [11]. Нітрозативний стрес не тільки відіграє важливу роль у виникненні патологічного ГЕР, але й може сприяти канцерогенезу стравоходу [13].

З’ясовано, що у процесах адаптації до чинників середовища підсилюється продукція NO: як за рахунок активації NO­синтази, так і — в подальшому — через посилення експресії генів, які кодують його синтез. Показано, що NO виступає в ролі універсального регулятора фізіологічних систем та генетичного апарату клітин і відіграє важливу роль у механізмі стрес­реакції та адаптації до стресу [4, 9, 16].

Основний фермент біосинтезу оксиду азоту — NO­синтаза (NOS), а субстратом виступають L­аргінін, L­гомоаргінін і NG­метил­L­аргінін. Розрізняють конститутивну та індуцибельну NOS. Перший фермент завжди міститься в клітині, а його наявність встановлено в клітинах надниркових залоз, ендокарда і міокарда, ендотеліоцитах, гліальних клітинах, центральних і периферичних нейронах, мегакаріоцитах, тромбоцитах. Конститутивні NOS — менш потужні ферменти, ніж індуцибельні, вони є кальцій­ і кальмодулінзалежними, функціонують відносно автономно стосовно чинників зовнішнього середовища та регуляторних систем макроорганізму [3].

Найпотужнішою є кальційнезалежна індуцибельна NOS, що індукується цитокінами. Міститься в макрофагах, гепатоцитах, фібробластах, моноцитах, лімфоцитах, купферівських клітинах, еозинофілах і нейтрофілах, активується антигенами мікроорганізмів та деякими цитокінами. Відомо, що оксид азоту, який продукується різними структурами, має унікальну здатність розслабляти гладенькі м’язи, проте є дані щодо специфічності впливу NO, продукованого різними джерелами. Так, NO, що синтезується лейкоцитами й нейронами, регулює моторику кишечника, викликає релаксацію круглих м’язів прямої кишки, тонічно інгібує ділянку пілоруса [3, 15].

Найбільша кількість нейронів, що містять NO, виявлена в нервових сплетеннях сфінктерних зон [10]. Стимуляція NANC­нейронів приводить до біосинтезу й виділення оксиду азоту, який за рахунок цГМФ викликає релаксацію шлунка, гладеньких м’язів нижньої частини стравоходу й дванадцятипалої кишки [11].

Взаємозв’язок метаболізму NO, зниження тиску НСС і патологічного рефлюксу підтверджують патогенетичне значення NO в розвитку й прогресуванні ГЕРХ [2]. Проте ми не виявляли досліджень щодо метаболізму NO у хворих із різними варіантами захворювання, позастравохідними проявами з урахуванням гістоморфологічної картини слизової оболонки (СО) стравоходу, що є основним і об’єктивним критерієм верифікації патології стравоходу.

Метою даного дослідження було уточнення ролі оксиду азоту в перебігу різних варіантів ГЕРХ із вивченням морфологічної структури СО стравоходу.

Об’єкт і методи дослідження

Обстежено 50 хворих на ГЕРХ військовослужбовців­чоловіків: 26 — із неерозивною рефлюксною хворобою (НЕРХ) і 24 — із ерозивною рефлюксною хворобою (ЕРХ), віком від 19 до 32 років (середній вік (25,6 ± 2,3) року). Групу контролю склали 25 практично здорових осіб, порівнянних за статтю і віком. Діагноз ГЕРХ встановлювали на підставі клінічних проявів, результатів ФЕГДС і внутрішньостравохідного рН­моніторування. Рівень NO в нейтрофілах і тромбоцитах визначали методом електронної парамагнітно­резонансної спектроскопії. Біоптати СО стравоходу фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, проводили через батарею спиртів висхідної концентрації та заливали в парафінові блоки з подальшим виготовленням гістологічних зрізів товщиною 4–6 МК. Отримані препарати фарбували гематоксиліном і еозином та пікрофуксином за ван Гізоном. Дослідження мітотичного режиму та стан патологічних мітозів вивчали згідно з класифікацією І.О. Казанцевої (1981 р.). Мітотичні клітини рахували не менше ніж у 100 полях зору мікроскопу, мітотичний індекс виражали у промілях (‰). Спектр патологічних мітозів досліджували залежно від фаз мітозу з нормальним перебігом, з подальшим визначенням провідної фази, яку виражали у відсотковому співвідношенні (%).

Статистичну обробку даних проводили за допомогою методів варіаційної статистики. Вірогідність різниці при порівнянні середньоарифметичних величин визначали за допомогою критерію t Стьюдента, а при порівнянні частот ознаки — із вираховуванням критерію Пірсона . Для встановлення ступеня кореляційного зв’язку між якісними ознаками використовували тетрахоричний коефіцієнт кореляції (r_А).

Результати та їх обговорення

Рівень оксиду азоту в нейтрофілах і тромбоцитах хворих на ГЕРХ був вірогідно вищим, ніж у контрольній групі (табл. 1, рис. 1).

Так, у хворих на НЕРХ рівень NО нейтрофілів перевищував контрольні показники у 3,3 раза: (2,55 0,45) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв проти (0,79  0,05) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв у контролі, р < 0,001.

У хворих на ЕРХ рівень NО нейтрофілів (конт­рольований індуцибельною NOS) перевищував контрольні показники у 5,3 раза, досягнувши (4,23 ± 0,54) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв, та виявився у 1,6 раза вищим, ніж при НЕРХ — (2,55 ± 0,45) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв, р < 0,001. Показники вмісту NО в тромбоцитах (контрольованих конститутивною NOS) були нижчими, ніж у нейтрофілах, проте вірогідно вищими в групах НЕРХ та ЕРХ — (2,44 ± 0,41) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв та (3,98 ± 0,53) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв відповідно порівняно з контрольною групою — (0,77 ± 0,08) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв, відмінності між групами вірогідні, р < 0,001.

У хворих на НЕРХ із позастравохідними проявами (І­А група) активність NО нейтрофілів займала проміжне положення між показниками НЕРХ та ЕРХ (табл. 2, рис. 1).

Так, при кашлі, асоційованому з НЕРХ, рівень NО нейтрофілів перевищував контрольні показники у 3,6 раза і становив (2,83 ± 0,51) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв, р < 0,001. При кардіалгіях, асоційованих із НЕРХ, рівень NО нейтрофілів перевищував контрольні показники у 4,9 раза і становив (3,85 ± 0,64) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв, р < 0,001.

У хворих із респіраторними й кардіальними проявами ГЕРХ мали місце різноспрямовані тенденції змін NО нейтрофілів та тромбоцитів. Так, індекс відношення NО нейтрофілів до вмісту NО нейтрофілів та тромбоцитів (NО_n/NО_n + NO_tr) становив 0,5 у групах НЕРХ, ЕРХ та в контрольній групі. У групі з респіраторними проявами виявляли його зниження до (0,43 ± 0,05), що може свідчити про більший вплив конститутивної NOS у хворих із респіраторними масками, а в групі з кардіальними проявами — про підвищення до (0,60 ± 0,07), р < 0,01, що може свідчити про більший вплив індуцибельної NOS у хворих із кардіальними позастравохідними масками і може бути предметом окремих досліджень.

Для уточнення тісноти зв’язку між різними варіантами ГЕРХ та підвищенням NО проведено кореляційний аналіз з обчисленням тетрахоричного показника зв’язку (r_А). Встановлено вірогідний (р < 0,02) помірний прямий кореляційний зв’язок між наявністю катарального рефлюкс­езофагіту й підвищенням NО нейтрофілів і тромбоцитів, r_А = +0,62 та r_А = +0,46 відповідно (табл. 3).

При ЕРХ встановлено вірогідний (р < 0,01) значний прямий кореляційний зв’язок між наявністю ерозивного рефлюкс­езофагіту й підвищенням NО, r_А = +0,67 та r_А = +0,63.

Отримані дані свідчать про важливу роль оксиду азоту не тільки в перебігу різних форм ГЕРХ із підвищенням показника при ерозивному пошкодженні, що підтверджує дані попередніх досліджень [2], але і в перебігу кардіальних і бронхопульмональних проявів НЕРХ, що певною мірою пояснює недостатню ефективність короткочасного прийому інгібіторів протонної помпи в купіруванні екстраезофагеальної симптоматики.

Серед морфологічних змін СО стравоходу у хворих на НЕРХ превалювали дистрофія епітелію — у 16 (61,5 %) хворих та гіперплазія поверхневого шару епітелію — у 14 (53,8 %) хворих, проте вони не відрізнялись за частотою в групах порівняння (табл. 4).

Для гістологічних препаратів групи НЕРХ характерною була дифузна, переважно лімфо­плазмоцитарна інфільтрація у власній пластинці у 8 осіб (30,8 %) та в підслизовому шарі СО стравоходу в 4 (15,4 %), рідше зустрічались нейтрофільна інфільтрація — у 4 (15,4 %), гістіоцити — у 3 (11,5 %), еозинофіли — у 2 (7,7 %). Осередкові запальні інфільтрати поодиноко формувалися навколо кістозно змінених вивідних проток залоз, а в підслизовій оболонці — периваскулярно. В 1 (3,8 %) пацієнта виявляли лімфоїдні фолікули з реактивними центрами у фовеолярних ямках субепітеліального шару.

Характерною особливістю ЕРХ було збільшення кількості сосочків у 18 (75,0 %) осіб, що було вірогідно частіше (18,11; р < 0,001) порівняно з групою НЕРХ (11,5 %), причому їх кількість корелювала з тривалістю захворювання (r = +0,402; р < 0,05). Гіперплазія базального шару, набряк епітелію та нейтрофільна інфільтрація зустрічались вірогідно частіше в групі ЕРХ (р < 0,001) порівняно з НЕРХ (табл. 4), що підтвердило дані попередніх досліджень [7].

Фігури мітозу переважали в середній частині епітелію у 15 (57,7 %) пацієнтів групи НЕРХ. Мітотичний режим епітелію СО стравоходу характеризувався високим індексом та становив (5,25  0,60) ‰. Кількісний та якісний аналіз розподілу фаз мітозу з нормальним перебігом показав переважання метафази ((40,8  0,4) %) порівняно з іншими етапами нормального мітотичного поділу клітин (табл. 5).

При дослідженні відхилень від нормального перебігу мітозу в групі НЕРХ виявлено поодинокі форми патології мітозів у 15,3 % (4 із 26) пацієнтів: у 3 (11,5 %) спостерігалась патологія профази мітозу — так звані містки та затримка при розходженні хромосом із частотою у 0,2 %, в 1 (3,8 %) — патологія метафази — К­мітоз із розсіюванням хромосом із частотою в 0,1 %, що може свідчити про фізіологічні компенсаторно­пристосувальні процеси репарації епітелію СО на тлі лужного рефлюксу. Базальна мембрана епітелію в пацієнтів групи НЕРХ не змінювалась на всьому протязі гістологічних препаратів, зберігала свої розміри, рідко виявляли її потовщення та незначне склерозування (табл. 4).

Разом із гістологічними ознаками ЕРХ у вигляді вищої частоти гіперплазії базального шару, набряку епітелію та нейтрофільної інфільтрації у 13 (54,2 %) пацієнтів мали місце дистрофічно­некротичні зміни епітелію з наявністю гіперемії судин. Дифузні лімфоплазмоцитарні інфільтрати з домішками полінуклеарних нейтрофілів і поодиноких еозинофілів розташовувались як у ділянці сосочків, так і в більш глибоких субепітеліальних шарах, із розшаруванням м’язових волокон.

У випадках довготривалого патологічного процесу у 3 (12,5 %) хворих ЕРХ виявляли судини з елементами продуктивного васкуліту. Клітинні інфільтрати мали поліморфний вигляд, у них домінували моноцити, плазматичні клітини, лімфоцити та макрофаги, зрідка зустрічались клітини фібробластичного ряду.

При проведенні кореляційного аналізу встановлено вірогідний (р < 0,01) помірний прямий кореляційний зв’язок між наявністю нейтрофільної інфільтрації та підвищенням NО нейтрофілів з r_А = +0,532. Крім того виявляли, взаємозв’язок ступеня вираженості акантозу та ендоскопічної характеристики поширеності патологічного процесу (r = +0,417; р < 0,05).

У 4 (16,7 %) пацієнтів групи ЕРХ у полях зору мікроскопу в СО стравоходу переважали специфічні головні, обкладові та муцинпродукуючі клітини, що нагадували фундальний тип будови епітелію шлунка, у 2 (8,33%) пацієнтів мав місце кардіальний тип епітелію будови шлунка. При дослідженні мітотичного індексу встановлено вірогідне його зростання (р < 0,05) до (6,65  2,40) ‰ порівняно з НЕРХ — (5,25  2,20) ‰ та переважання (р < 0,001) профази — (44,8  0,5) % порівняно з (26,6  0,3) % (табл. 6).

Як показали результати морфологічних та математичних досліджень щодо якісного та кількісного вивчення патологічних мітозів на гістологічних препаратах (табл. 6), у групі ЕРХ переважали функціональні форми патології, що не пов’язані з грубим ушкодженням мітотичного апарату клітин та хромосом, а також кінетохорів ділення, проте зустрічалися частіше, ніж у групі НЕРХ.

При проведенні кореляційного аналізу між рівнем NО і кількісними характеристиками патологічних мітозів кореляційних зв’язків не виявляли (r = +0,187; р > 0,05).

Висновки

У хворих на ГЕРХ військовослужбовців відбувається вірогідне підвищення рівня оксиду азоту в нейтрофілах і тромбоцитах, що позитивно корелює зі ступенем пошкодження СО стравоходу. Так, у хворих на НЕРХ рівень NО нейтрофілів перевищував контрольні показники у 3,3 раза: (2,55 ± 0,45) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв проти (0,79 ±± 0,05) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв у конт­ролі, р < 0,001, та мав місце прямий кореляційний зв’язок між наявністю катарального рефлюкс­езофагіту й підвищенням NО з рівнем r_А = +0,62, р < 0,02.

У хворих на ЕРХ рівень NО нейтрофілів перевищував контрольні показники у 5,3 раза, досягнувши (4,23 0,54) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв, та виявився у 1,6 раза вищим, ніж при неерозивній формі хвороби — (2,55  0,45) нмоль/1 · 10⁶  клітин · хв, р < 0,001. При цьому мав місце значний прямий кореляційний зв’язок між наявністю ерозивного рефлюкс­езофагіту й підвищенням NО з рівнем r_А = +0,67, р < 0,01.

Підвищення вмісту NО нейтрофілів і тромбоцитів у хворих на НЕРХ із позастравохідними проявами свідчить про важливу роль оксиду азоту в перебігу кардіальних і бронхопульмональних проявів: при кашлі, асоційованому з НЕРХ, рівень NО нейтрофілів перевищував контрольні показники у 3,6 раза і становив (2,83  0,51) нмоль/1 · 10⁶ клі­тин · хв, при кардіалгіях рівень NО нейтрофілів перевищував контрольні показники у 4,9 раза і становив (3,85  0,64) нмоль/1 · 10⁶ клітин · хв, р < 0,001.

Для хворих на НЕРХ характерні дистрофія (у 61,5 %), гіперплазія поверхневого шару епітелію (у 53,8 %) та лімфоплазмоцитарна інфільтрація (46,2 %). У хворих на ЕРХ частіше (р < 0,001), ніж при НЕРХ, зустрічаються гіперплазія базального шару, набряк епітелію та нейтрофільна інфільтрація, що позитивно корелювала з підвищенням NО нейтрофілів (r_А = +0,53), збільшення кількості сосочків, що корелювало з тривалістю захворювання (r = +0,40).