Украинский журнал хирургии 2 (11) 2011

Важное значение в развитии спаечного процесса брюшной полости имеют факторы и механизмы неспецифического воспаления, гипоксии и образования соединительнотканных элементов. Но полученные данные не дают полного представления о механизмах, противоположных по действию, то есть обладающих протективным влиянием [1, 6].

Среди таких механизмов, по нашему мнению, следует особо отметить системы протеолиза и фибринолиза ткани париетальной и висцеральной брюшины, а также перитонеального экссудата [2, 4, 5]. Изучение динамики данных показателей при остром воспалительном процессе с локализацией в брюшной полости дает возможность определить наиболее ответственные и значимые индигенные противоадгезивные механизмы.

В связи с вышеизложенным, мы задались целью изучить динамику изменений систем протеолиза и фибринолиза в условиях острого воспаления брюшины, как основной причины формирования спаечного процесса и спаечной болезни (СБ).

Материал и методы

В соответствии с поставленными заданиями исследования, работа имеет экспериментальный характер. Выбор такого исследовательского протокола обусловлен существенными методологическими трудностями динамического наблюдения за больными со спаечной болезнью в процессе формирования спаечного процесса, а также необходимостью забора материала для исследования, что связано с многократными повторными оперативными вмешательствами.

Воспалительный процесс моделировали у экспериментальных животных – 57 белых крыс линии Wistar [3]. Все животных подлежали обязательному карантину (10-14 суток) в виварии Буковинского государственного медицинского университета перед осуществлением исследования, осматривались на предмет возможных патологий, беременности и т.д. Для исследования отбирались половозрелые, среднего возраста крысы обеих полов, массой не меньше 200-250 г., без явных признаков заболеваний и с нормальными показателями основных лабораторных тестов (общий анализ крови и мочи), животных кормили один раз по утрам, энергетическая ценность пищи составляла не менее чем от 5,6 до 6,2 кдж на кг массы в сутки, воду давали в неограниченном количестве. В случае необходимости животных дополнительно докармливали, но накануне операции животных переводили на голодную диету.

Наркоз осуществляли внутрибрюшинным или подкожным) введением необходимого количества 5% раствора тиопентала натрия (0,05 мг на 100г массы) после премедикации, для которой использовали раствор атропина сульфата (0,1% – 0,005 мл на 100г весы), димедрола 1% 0,05 мл. и калипсол из расчета 0,2 мг на 100 г массы тела животного, или с помощью эфирного наркоза. Эвтаназию экспериментальных животных осуществляли согласно этическим стандартам и действующим нормативным рекомендациям, в состоянии глубокого наркоза, путем введения избыточного количества наркотического препарата, или декапитации под наркозом согласно нормативным актам в сфере биоэтики.

Определение интенсивности ферментативного (ФФА) и неферментативного (НФА) фибринолиза в биологических жидкостях и биоптатах осуществляли с помощью азофибрина «Simko Ltd.» (Украина). Состояние протеолитической активности (ПА) плазмы крови и гомогенатов тканей касательно разных белковых фракций оценивали в реакции с азоальбумином, азоказеином и азоколом (азоколлагеном) «Биомарк» (Украина) [74]. В качестве контрольного показателя сравнения использовали результаты изучения динамики изменений соответствующих показателей в плазме периферической крови.

Обработка полученных баз данных проводилась методами вариационной статистики с использованием критериев W. Gusset (Student) и R. Fisher, с использованием программных пакетов Origin^® 7.0 (Microcal Software^™/Origin Labs^®) и Excel^® XP^™ build 10.6612.6625-SP3 (Microsoft^®), Statistica^™ 6.0 (Statsoft^® Inc).

Результаты и обсуждение

Результаты изучения динамики изменений показателей фибринолитической активности (ФА) плазмы крови экспериментальных животных при моделировании острого воспаления брюшины приведены в таблице 1. Развитие воспалительного процесса в брюшине характеризуется существенными изменениями ФА плазмы крови экспериментальных животных. Уже в период инициации перитонита, фактически, когда воспаление еще не стало необратимым выявлено резкое (почти в 2 раза) угнетение ФА. В последующем, суммарная фибринолитическая активность (СФА) плазмы была достоверно выше на протяжении всего периода наблюдения. Тем не менее, определённых достоверных изменений СФА плазмы на протяжении разных периодов развития не наблюдали. Очевидно, что значение суммарной ФА плазмы зависит от многих факторов (гуморального и клеточного иммунитета, системы комплемента, лизоцима, специфических фибринолитических факторов, плазмин-плазминогена, трипсинов, и т.д) и поэтому мы осуществили исследование составляющих, которые формируют этот параметр [1, 7]. В частности, изучена динамика изменений специфической энзимзависимой составляющей ФА (ФФА) и обусловленной действием неспецифических факторов фибринолиза (НФА). Фактические результаты изучения динамики изменений ферментной и неферментной составляющих ФА при воспалении брюшины также приведены в таблице 1. Значительный (почти в 2 раза) рост ФФА наблюдается уже в течении первых суток эксперимента. Через 48 часов развития патологического процесса наблюдали незначительный рост ФФА, однако, в отличие от СФА, в последующем (через 72 год) наблюдается достоверная (P<0,05) тенденция к снижению ФФА плазмы крови экспериментальных животных. Следует также отметить, что в этот период на аутопсии экспериментальных животных в большом количестве определяли свежие адгезии и образование сращений.

Показатель НФА плазмы крови значительно возрастал через 24 часов моделирования, в течении 48 часов тенденция к его росту сохранялась, однако через трое суток появлялась тенденция к снижению данного показателя, что по нашему мнению подтверждает истощение факторов фибринолиза, как одного из вероятных механизмов предотвращения образования сращений. Наивысшего уровня показатели фибринолитической активности плазмы крови (СФА, НФА, ФФА) достигают через 48 год развития абдоминального сепсиса. Во всех случаях зафиксированная разного уровня достоверности тенденция к снижению ФА через 72 год эксперимента. Тенденцию к снижению всех видов ФА, а больше всего ФФА, склонны объяснять усиленной утилизацией факторов фибринолиза, что возникает как реакция на распространенную микроциркуляторную гиперактивированную коагуляцию воспалительно-реактивного характера в результате транслокации микроорганизмов – возбудителей патологического процесса и продуктов их метаболизма (токсинов) в кровеносное русло, в первую очередь мезентериального дерева. Таким образом, выявленные изменения можно объяснить как вариант проявления защитной реакции на развитие гиперкоагуляции в результате синдрома системной воспалительной реакции и ДВС-синдрома со следующим истощением физиологичных механизмов компенсации и значительным доминированиям неферментного фибринолиза. Определение показателей фибринолитической активности плазмы также может иметь реальное диагностическое значение. В частности, значительный рост СФА, а также относительный рост НФА за счет ФФА могут свидетельствовать об ухудшении прогноза и последующем истощении фибринолиза, риске развития СБ. Определение ФА плазмы крови дает представление о развитии ДВЗ-синдрома и в известной мере его роль в развитии нарушений микроциркуляции, что также важно с точки зрения формирования спаечного процесса.

Определение интенсивности фибринолиза экссудата брюшной полости показало (табл. 2.), что в общем, воспалительный экссудат обладает более выраженным фибринолитическим потенциалом, что вполне объяснимо, поскольку в очаге воспаления концентрируются различные факторы, проявляющие ФА. Но значительно более информативным оказалось определение динамики изменения показателей фибринолиза в течении эксперимента. Особо следует отметить резкое (практически двукратное) уменьшение СФА выпота при сравнении показателей в начале (12 часов) и в конце (72 часа) эксперимента. Сравнение соответствующих показателей ферментной и неферментной ФА (табл. 2.) экссудата в различные периоды развития воспалительного процесса также подтверждает мысль об угнетении ФА перитонеального выпота с течением воспалительного процесса. Основываясь на данных, изложенных в табл. 2, можно предположить, что ФА ткани воспаленной брюшины также будет иметь подобную тенденцию к уменьшению с течением заболевания.

Данные таблицы 3 свидетельствуют, что инициация воспалительного процесса в полости живота приводит к значительному усилению процессов фибринолиза, что обуславливается действием различных цитокинов, принимающих участие в воспалении. Однако, в дальнейшем, гиперфибринолиз постепенно уменьшается, причем тенденция к постепенному угнетению ФА ткани брюшины наблюдалась в течение всего эксперимента. Сравнение данных динамики ФА различных изученных биологических субстратов позволяет сделать определенные выводы. В частности, наивысшие уровни ФА наблюдались в гомогенате брюшины, а наиболее низкие – в плазме. По-видимому, данный факт объясняется тем, что концентрация факторов, обладающих ФА гораздо выше в очаге воспаления, а также тем, что в ткани брюшины в большом количестве присутствуют многочисленные тканевые факторы, также обладающие ФА. Определение динамики ФА активности биосубстратов имеет значение в определении механизмов адгезиообразования, однако еще более необходимым является изучение механизмов протеолиза и динамики изменения данных параметров при остром воспалении брюшины, с целью выяснения роли протеолиза в возникновении спаечного процесса. Поскольку ферментные системы, которые обладают ФА по своему физиологическому действию интимно связаны с протеолитическими ферментами, а часто представлены одними и теми же энзимами, считали целесообразным исследовать активность факторов протеолиза плазмы крови, а также наиболее важных, с точки зрения спайкообразования биосубстратов – экссудата и брюшины.

Как свидетельствуют данные, приведённые в таблице 4, в начальном периоде эксперимента наблюдали существенный рост ПА относительно альбумина, коллагена и казеина (в 2,37, 1,23 и в 2,15 раза соответственно). В течение суток со времени моделирования воспалительного процесса наблюдали существенное снижение ПА плазмы крови относительно основных белковых фракций в сравнении с началом эксперимента. ПА относительно низкомолекулярных белков в реакции с азоальбумином снижалась почти вдвое, ПА относительно коллагена – почти в четыре раза, а ПА относительно высокомолекулярного азоказеина уменьшалась на 36,1%.

В дальнейшем также наблюдали волнообразную динамику изменений ПА плазмы крови – тенденцию к росту ПА относительно альбумина через 48 ч эксперимента, которая в дальнейшем изменялась на снижение ПА относительно низкомолекулярных белков; – более чем трёхкратное снижение протеолитической активности относительно коллагена в течение 48 ч со следующим резким ростом этого вида ПА через 72 ч; – по отношению к высокомолекулярным белкам ПА плазмы крови снижалась, как через 48 ч, так и через 72 ч эксперимента.

Таким образом, формирование воспалительного процесса в брюшинной полости сопровождается существенными изменениями ПА плазмы крови относительно всех основных белковых фракций (низкомолекулярных альбуминов, среднемолекулярного коллагена и высокомолекулярного казеина). Относительно всех классов белков характерным является рост ПА плазмы крови только в течение начального периода развития воспаления, а в дальнейшем характерной становится волнообразная кривая распределения протеолитической активности. Следует особо отметить, что для ПА относительно высокомолекулярных белков характерной есть постепенная тенденция к снижению до конца эксперимента.

ПА экссудата брюшинной полости при воспалении (табл. 5.) несколько отличалась от таковой плазмы крови. Важно отметить, что только протеолиз коллагена повышался с течением эксперимента. ПА экссудата по отношению низко- и высокомолекулярным белкам (альбумину и казеину) несколько возрастала, но через 72 часа уменьшалась. Хотя протеолиз коллагена и возрастал с прогрессированием воспалительного процесса, абсолютный показатель интенсивности ПА был самым низким.

Протеолиз высокомолекулярных белков был доминирующим в гомогенате ткани брюшины (табл. 6.), при этом наблюдали рост в течение всего эксперимента. Только в конце наблюдения появилась тенденция к уменьшению этого показателя. Важно отметить, что, невзирая на почти восьмикратное увеличение коллагенолиза, через 72 часа интенсивность протеолиза коллагена уменьшалась до уровня исходных величин.

Выводы

1. Спаечной болезни присуща определённая фазность развития изменений от альтернативного повреждения и неспецифического воспаления до формирования достаточно дифференцированной соединительной ткани вплоть до изменений дегенеративного характера.

2. Несмотря на возрастание параметров протеолиза в брюшной полости и в организме в целом, в последующем при отсутствии адекватной коррекции наступает угнетение фибринолиза-протеолиза и таким образом создаются условия для возникновения выраженного спаечного процесса.

Перспектива дальнейших исследований состоит в разработке методов коррекции выявленных нарушений.