Журнал «Медицина неотложных состояний» 4 (67) 2015

Статья опубликована на с. 39-44

Вступ

Сучасний етап удосконалення лікування постраждалих із поєднаною травмою (ПТ) в Україні характеризується зміною науково-практичної концепції — від статичної теорії травматичного шоку до динамічної концепції травматичної хвороби [7]. У патогенезі розвитку травматичної хвороби одне з провідних місць займає перекисне окислення ліпідів (ПОЛ), що являє собою первинну реакцією, яка призводить до деструкції ліпопротеїдного комплексу мембран і порушує їх транспортну функцію, а також пригнічує процеси генерації енергії, що в кінцевому підсумку знижує життєдіяльність клітин [3, 16]. Ці процеси є найбільш суттєвими та значимими в адаптивному оновленні та репарації ліпопротеїдних мембран, зростанні потужності та буферної ємності редокс-систем, підвищенні ефективності ферментативного та неферментативного антиоксидантного захисту (АОЗ) [12, 19].

Одним з органів, найбільш схильних до системної мембранопатії, є легені, оскільки активні форми кисню перш за все діють на альвеолярну поверхню легенів, вкриту сурфактантом, що складається на 90 % із фосфоліпідів та на 5–10 % із білків. У тканинах легенів під впливом ПТ найбільша інтенсифікація ПОЛ і виснаження системи АОЗ спостерігається на 3-тю добу, проте до початку проявів травматичної хвороби у тканині легенів інтенсивність ПОЛ та АОЗ не досліджена [2, 5, 8, 16].

Альвеолярні макрофаги є першими імунологічно-компетентними клітинами, що взаємодіють з антигеном і потім представляють його Т-лімфоцитам. Цитоплазма макрофагів містить велику кількість лізосом, що мають набір гідролітичних ферментів: пероксидази, каталази (КАТ) й оксидазно-ферментативний комплекс — нікотинамідаденіндинуклео–тидфосфат (НАДФ), що забезпечують виділення бактеріоцидного супероксид-аніону кисню (O^2–) [16, 20, 21].

Утворений O^2– є попередником широкого спектра вільних радикалів і пероксидів органічних та неорганічних сполук, що обумовлюють пошкодження та деструкцію білків і ліпідів мембран, нуклеїнових кислот об’єкта фагоцитозу, — синглетного кисню (О₂^–), гідроксильного радикала (ОН^–), пероксиду водню (Н₂О₂). За цих умов у нейтрофілах 90 % кисню відновлюється до O^2–, розвивається так званий кисневий спалах, або «дихальний вибух». Вільнорадикальне окислення є універсальним механізмом, за допомогою якого контролюються найважливіші гомеостатичні фізико-хімічні параметри клітини: в’язкість, вибіркова проникність і цілісність клітинних мембран [24, 26].

Процеси ПОЛ починаються в мітохондріях, причому спостерігається як утворення вільнорадикальних продуктів ПОЛ, так і перегрупування подвійних зв’язків у дієнову кон’юговану систему, тобто дієнові кон’югати (ДК), та в карбонільні сполуки, наприклад малонового діальдегіду (МД) як метаболіту кінцевого продукту ПОЛ, частка якого становить 40 % усіх метаболітів [1, 4, 13, 24]. З ушкоджувальним ефектом цих сполук пов’язують порушення структури й експресії мітохондріального геному клітин унаслідок конверсії мікросомального цитохрома Р450 в нативну форму Р420. Пошкоджені мітохондрії втрачають здатність накопичувати іони кальцію (Ca²⁺), що підвищуєть активність мембранних фосфоліпази, призводить до накопичення вільних жирних кислот та збільшує інтенсивність ПОЛ, отже, через нестачу енергії настає апоптоз клітин [1, 12].

При цьому сам фагоцит захищений від дії вказаних вище агентів, оскільки в його цитоплазмі є комплекси захисних неферментних факторів (глутатіон, вітаміни Е, С, жирні кислоти) і ферментів (супероксиддисмутаза (СОД), глутатіонпероксидаза, КАТ, що інактивують H₂O₂) [11, 14, 25].

Першу лінію захисту становлять внутрішньоклітинні інгібітори вільнорадикального окислення: СОД, КАТ та пероксидаза. СОД за участі b-токоферолу каталізують каскад реакцій (формули 1–3) [18]:

                   2O^2– + 2Н⁺ → H₂O₂ + O₂,             (1)

або

                          Н⁺ + О₂^– → НО₂^–,                    (2)

та далі:

      НО₂^– + НО₂^– • ^{СОД чи спонтанно}    Н₂О₂ + О₂, (3)

причому H₂O₂, що утворюється під час різних окислювальних процесів флавопротеїдів в організмі, може розкладатися на КАТ або використовуватися в реакціях, що каталізуються пероксидазою [23]. Фермент КАТ, що бере участь у тканинному диханні, є другою ланкою захисту від власного О^2–. Взаємодія каталази з H₂O₂ відбувається у дві стадії, тобто вона може бути й окислювачем (формула 4), і відновником (формула 5) [9, 15]:

              R(Fe²⁺)₂ + H₂O₂ → R(Fe³⁺+OH^–)₂;    (4)                                       

                   H₂O₂ + H₂O₂ → O₂ + 2H₂О,          (5)

де R — молекула ферменту КАТ. Як і в разі СОД, швидкість реакції визначається дифузією і не вимагає енергії для активації [18].

Зростання активності СОД у тканинах органів черевної порожнини та легенях додатково свідчить про провідну роль утворення активних форм кисню в патогенезі тяжкої ПТ, що обумовлено оксидативним стресом і має місце у фазу «гіперметаболізму» травматичної хвороби [5, 22]. Як було наведено В.К. Казімірко і співавт. (2004), інтенсифікація вільнорадикальних процесів і ПОЛ спостерігається при розвитку загального неспецифічного адаптаційного синдрому (стресу) [6]. Активація ПОЛ є універсальним механізмом розвитку запалення та тканинної дистрофії, в процесі яких переплітаються механізми судинно-тромбоцитарного гемостазу [17, 25].

Через це динаміка змін показників системи ПОЛ та антиоксидантного захисту є одним із критеріїв міри напруження реакцій адаптації у постраждалих із ПТ, інтегральну оцінку якої відображає індекс оксидації (ІО) [6, 8]. Саме у період із 6 до 48 год після травмування розгортаються основні патофізіологічні реакції, що обумовлюють дисбаланс оксидант-антиоксидантних систем. У цей же період, а саме до завершення першої доби, у більшості постраждалих розвивається дистрес-реакція органів та систем, що в подальшому призводить до розвитку системної поліорганної недостатності [7, 22, 27].

Вищезазначене стало теоретичною передумовою для проведеного нами експериментального дослідження з вивчення впливу комбінованої інфузійної терапії за умов гемічної гіпоксії на початок розвитку гострого періоду ПТ у піддослідних тварин. Причому початок розвитку ПТ як на морфологічному, так і біохімічному рівні, особливо відповідає змінам у тканині легенів як органу-мішені. Тому при застосуванні препарату HAES-LX-5% та препарату колоїдної інфузійної терапії рефортан проведено порівняльний аналіз виживання тварин у додобовий період ПТ.

Мета дослідження — в умовах експериментальної тяжкої ПТ вивчити вплив інфузійної терапії на редокс-баланс оксидант-антиоксидантних систем, на основі оцінки відношення між показниками системи перекисного окислення ліпідів (МД і ДК) та антиоксидантної ланки ферментів (СОД і КАТ) у тканині легень піддослідних тварин. Причому стає можливим встановити вплив комбінованої інфузійної терапії на виживання при її застосуванні вже на початку гострого періоду ТП.

Матеріали та методи

У статевозрілих самців білих щурів (лінії Wistar) масою від 200 г до 220 г змодельовано тяжку ПТ органів черевної порожнини. Тварин обстежували через 1, 6, 12 та 24 год після нанесення ПТ. Кожна дослідна підгрупа включала 12 тварин. У подальшому нами було сформовано такі групи досліджень: ГД-1 — травма без проведення лікування (n = 48); ГД-2 — травма та застосування препарату рефортан (n = 48); ГД-3 — травма та застосування препарату HAES-LX-5% (n = 48). Отримані дані порівнювали з групою контролю (ГК) — 12 здорових тварин, яких тільки вводили в наркоз. Стан ферментативної системи ПОЛ визначали у тканинах легень тварин, які залишались живими впродовж експерименту. Активність КАТ (КФ 1.11.1.6) визначали за швидкістю утилізації H₂O₂ з використанням FOX-реактиву. Активність СОД (КФ 1.15.1.1.) розраховували за відсотком гальмування реакції автоокислення кверцетину, зарахованому до кількості протеїдів у пробі (мг) (за методом В.А. Костюкова, 1990) [10]. За характеристику груп для ознак із розподілом, відповідно до закону Гаусса, визначали середнє арифметичне значення та стандартну похибку (M ± m).

З метою оцінки відношення між системами ПОЛ та АОЗ використовувався інтегральний показник — ІО (ум.од.) як співвідношення середнього значення вмісту ланки ферментів у травмованої тварини та контролю, поділеного на кількість доданків, за впровадженою нами формулою (6), причому нормальні значення знаходяться в межах (0,9–1,1):

де т — травмовані піддослідні тварини; к — піддослідні тварини ГК.

Динаміку змін ІО та показника виживання піддослідних тварин відображено у вигляді поліноміальної лінії тренда через 1, 6, 12 та 24 год після нанесення ПТ. Близькість значень лінії тренда до фактичних даних визначали на підставі коефіцієнта вірогідності апроксимації (R²), що обчислюється в межах від 0 до 1. Якщо значення R² близьке до 1, то поліноміальна лінія тренда найбільшою мірою наближається до наведеної на діаграмі залежності та відображає прогноз подальшої динаміки тренда.

Результати та обговорення

Дані проведеного експериментального дослідження подано в табл. 1 і 2. На початковому етапі дослідження встановлено, що у відповідь на ПТ органів черевної порожнини в ГД-1 відзначались односпрямовані відхилення активності метаболітів кінцевого продукту ПОЛ — МД та ДК у тканинах легенів тварин у бік зростання з 1 до 24 год експерименту, з тенденцією до подальшого зростання (табл. 1).

А саме, в ГД-1 через 1 год. експерименту активність МД зросла порівняно з ГК (0,025 ± 0,003 мкмоль/кг) на 84,0 %, через 6 год досягла збільшення у 2,9 раза, через 12 год — у 4,8 раза та до 24 год зросла у 6,7 раза (0,168 ± 0,050 мкмоль/кг).

Також через 1 год експерименту активність ДК порівняно з ГК (0,211 ± 0,070 ум.од./мг) досягала збільшення у 2,1 раза, через 6 год — у 2,9 раза, через 12 год — у 3,1 раза та до 24 год зросла у 3,3 раза (0,69 ± 0,09 ум.од./мг), але відзначається щодо повільного зростання активності ДК до 12 та 24 год порівняно зі зростанням активності МД. Це вказує на дисбаланс активності цих ферментів у тварин, яким не проводилось лікування в умовах оксидативного стресу при ПТ.

У ГД-2 та ГД-3 відзначалось хвилеподібне зростання рівня активності МД та ДК із 1 до 6 год експерименту та зниження на 12 год із тенденцією до подальшого зростання до 24 год експерименту (табл. 1). Але в ГД-3 виявляються менш повільні хвилеподібні зміни активності цих ферментів, тобто через 1 год експерименту активність МД зросла порівняно з ГК (0,025 ± 0,003 мкмоль/кг) на 52,0 %, до 6 год відзначалось збільшення активності ферменту у 2,5 раза (0,065 ± 0,001 мкмоль/кг) та утрималось до 12 год, з подальшою тенденцією до зниження на 12,0 % до 24 год експерименту. Також через 1 год експерименту активність ДК порівняно з ГК (0,211 ± 0,070 ум.од./мг) досягала збільшення на 65,0 %, через 6 год — у 2,6 раза, але до 12 год активність ферменту зменшилась (0,366 ± 0,006 ум.од./мг) в 1,5 раза з тенденцією до попереднього подальшого зростання до 24 год у 2,1 раза (0,448 ± 0,030 ум.од./мг).

У відповідь на інтенсифікацію вільнорадикальних процесів та ПОЛ спостерігається підвищення активності ферментів АОЗ, а саме КАТ та СОД. У ГД-1 через 1 год експерименту активність КАТ зросла порівняно з ГК (3,67 ± 0,68 мккат/кг) на 15,0 %, через 6 год — на 20,0 %, через 12 год — на 30,5 %, але до 24 год відзначалося повільне зниження активності КАТ (3,64 ± 0,01 мккат/кг) до показника ГК (табл. 2).

Також через 1 год експерименту в ГД-1 спостерігалось зростання активності СОД порівняно з ГК (0,95 ± 0,18 ум.од./мг) на 13,7 %, через 6 год — на 93,7 %, через 12 год — збільшення у 2,1 раза, але до 24 год також відзначалося повільне зниження активності СОД (1,01 ± 0,01 ум.од./мг) до показника ГК.

Таким чином, у ГД-1 зниження активності показників ферментів АОЗ до 24 год експерименту та їх дисбаланс свідчать про порушення адаптивного співвідношення систем ПОЛ та АОЗ у тварин, яким не проводилось лікування з приводу ПТ.

Між показниками АОЗ у ГД-2 взагалі відзначаються динамічні зміни активності ферментів за типом «ножиць» (табл. 2), що вказує на підвищену здатність КАТ тривало зберігати свою активність в ураженому органі. Зниження ферментативної активності показників системи ПОЛ до 6 год та впродовж 12 год експерименту, з неухильним зростанням до 24 год характеризує порушення рівноваги ПОЛ — АОЗ ланки ферментів внаслідок виснаження активності системи АОЗ та прояви його дисбалансу як можливої реакції на гіпертрансформацію Н₂О₂, що провокуює клітинний апаптоз та некроз тканин легенів. Це обумовлює потребу в корекції інфузійної терапії при застосуванні препарату рефортан упродовж гострого періоду травматичного процесу.

У ГД-3 між показниками АОЗ відзначаються позитивні динамічні зміни активності ферментів вже на 6-ту та 12-ту год експерименту. Через 1 год експерименту активність КАТ зросла порівняно з ГК (3,67 ± 0,68 мкмоль/кг) на 6,2 % та утримувалась упродовж 6 год. До 12-ї год активність КАТ зросла в 1,7 раза (6,39 ± 0,01 мкмоль/кг) із подальшим зниженням активності практично до показників ГК (3,84 ± 0,01 мкмоль/кг), відповідно до чого через 1 год експерименту активність СОД зросла порівняно з ГК (0,95 ± 0,18 ум.од./мг) на 25,1 %, через 6 год — у 2,1 раза (1,92 ± 0,01 ум.од./мг) із тенденцією до подальшого зменшеня активності ферменту (0,92 ± 0,01 ум.од./мг) до показників ГК. До 24-ї год відзначається деяке виснаження ферментативної активності СОД (0,68 ± 0,01 ум.од./мг), що нижче за показник ГК на 40 % (табл. 2). На наш погляд, це пов’язано з індивідуальними особливостями організму: в одних — як результат адаптаційно-компенсаторних процесів, в інших — виснаження адаптаційних процесів, що слід ураховувати в тактиці експериментальної інтенсивної терапії.

Для більш ретельної оцінки відношення між системами ПОЛ та АОЗ в ГД-1, ГД-2 та ГД-3 проведено порівняльний аналіз показника ІО (табл. 3, рис. 1).

Встановлено, що в ГД-1 відзначається збільшення показника ІО від 1,6 ум.од. за 1 год експерименту до 3,24 ум.од. до 24 год. Тобто співвідношення середнього значення вмісту ланки ферментів у травмованих тварин, що не отримали лікування політравми, вказує на потужне зростання активності системи ПОЛ у 2 рази та дисбаланс у прооксидантно-оксидантному відношенні. У ГД-2 відзначається збільшення показника ІО від 1,3 ум.од. за 1 год eксперименту до 2,5 ум.од. до 24 год, що вказує на зростання активності системи ПОЛ в 1,9 раза, але динаміка зміни показника ІО значно менша, ніж у ГД-1. У ГД-3 виявляється збільшення показника ІО від 1,25 ум.од. за 1 год eксперименту до 1,45 ум.од. до 12 год, що вказує на зростання активності системи ПОЛ лише в 1,1 раза.

За даними стратифікаційного аналізу виживання піддослідних тварин встановлено, що у ГД-1 із 48 тварин померло 14, що становило 29,2 %; у ГД-2 — 9 (18,7 %) тварин; у ГД-3 померло 4 (8,3 %) тварини впродовж 24 год кожного експерименту (табл. 3, рис. 2).

Отже, у ГД-3 при використанні препарату HAES-LX-5% у піддослідних тварин відзначається повільна динаміка змін показника ІО та близького до нормального його значення, ніж в інших групах експерименту.

Висновки

1. У ранньому травматичному періоді (через 6 год після травмування та впродовж 12 год) відзначається зростання вмісту КАТ та СОД у тканинах легенів піддослідних тварин, що підтверджує активізацію АОЗ у відповідь на збільшення активності системи перекисного окислення при травмі незалежно від її тяжкості.

2. На фоні ранньої інфузійної терапії вже через 6 год перебігу травматичного періоду настає зниження активності показників ферментативної ланки оксидант-антиоксидантних систем та встановлення редокс-балансу, що підтверджено повільною динамікою зміни показника ІО та близького до нормального його значення при використанні препарату HAES-LX-5% у піддослідних тварин, ніж в інших групах експерименту.

3. Упродовж доби та через 24 год після травми отримано кращі результати виживання піддослідних тварин, яким уводили препарат комбінованої інфузійної терапії (HAES-LX-5%). Експериментальне дослідження підтверджує правило «золотої години» в хірургії про необхідність проведення раннього комплексного лікування постраждалих у гострому періоді травматичної хвороби незалежно від ступеня клінічних проявів.